シーケンシングデータからRNA修飾を検出するためのハイスループットな抗体不要の方法がいくつか開発されている。ここでは、IlluminaまたはNanoporeプラットフォームをベースとするRNA修飾検出アッセイのための多用途ソフトウェアソリューションおよび包括的な解析フレームワークとしてJACUSA2を紹介する。重要なことは、JACUSA2は、複製や異なる条件などの複数の実験や、1本鎖または2本鎖のcDNAライブラリなどの異なるライブラリタイプからの情報を統合できることである。著者らは、IlluminaまたはNanoporeのシーケンスデータセットにおけるN6-メチルアデノシン（m6A）とプソイドウリジン（Ψ）検出の解析ワークフローを示し、その有用性を実証した。このソフトウェアとRヘルパーパッケージは、オープンソースとして提供されている。
manual
https://github.com/dieterich-lab/JACUSA2/blob/master/manual/manual.pdf
インストール
v2.0.2 static binaryをリリースからダウンロードしてテストした（openjdk 11.0.1環境）。
依存
- tested JACUSA2 with Java v1.8
> java -jar JACUSA_v2.0.2-RC.jar
usage: JACUSA2 <METHOD> <METHOD-OPTIONs> <BAMs>
METHOD DESCRIPTION
call-1 Call variants - 1 condition
call-2 Call variants - 2 conditions
pileup SAMtools like mpileup - 2 conditions
rt-arrest Reverse Transcription Arrest - 2 conditions
lrt-arrest Linkage arrest to base substitution - 2 conditions
Version: 2.0.2-RC
Libraries: htsjdk 2.12.0, Apache commons-cli 1.4, Apache commpon-math3 3.6.1
> java -jar JACUSA_v2.0.2-RC.jar call-1
usage: JACUSA call-1 [OPTIONS] BAM1_1[,BAM1_2,...]
-A Show all sites - including sites without variants
-a <FEATURE-FILTER> [...] Use -h to see extended help
-B <READ-TAG> Tag reads by base substitution.
Count non-reference base substitution per read and stratify.
Requires stranded library type.
(Format for T to C mismatch: T2C; use ',' to separate substitutions)
Default: none
-b <BED> BED file to scan for variants
-c <MIN-COVERAGE> filter positions with coverage < MIN-COVERAGE
default: 5
-D Show deletion score
-d <MAX-DEPTH> max read depth
default: -1
-f <OUTPUT-FORMAT> Choose output format:
<*> B: BED6-extended result format
< > V: VCF Output format. Option -P will be ignored (VCF is unstranded)
-F <FLAG> filter reads with flags FLAG
default: 0
-filterNH <NH> Max NH-VALUE for SAM tag NH for all conditions
-filterNM <NM> Max NM-VALUE for SAM tag NM for all conditions
-h Print extended usage information
-I Show insertion score
-m <MIN-MAPQ> filter positions with MAPQ < MIN-MAPQ
default: -1
-p <THREADS> use # THREADS
default: 1
-P <LIB-TYPE> Choose the library type for all conditions:
RF-FIRSTSTRAND STRANDED library - first strand sequenced
FR-SECONDSTRAND STRANDED library - second strand sequenced
UNSTRANDED UNSTRANDED library
default: UNSTRANDED
-q <MIN-BASQ> filter positions with base quality < MIN-BASQ
default: 20
-R <REF-FASTA> use reference FASTA file (must be indexed)
-r <RESULT-FILE> results are written to RESULT-FILE
-s Store feature-filtered results in another file (= RESULT-FILE.filtered if no argument) or (= FILTERED-FILE)
-T <THRESHOLD> Filter positions based on test-statistic THRESHOLD
default: DO NOT FILTER
-u <MODE> [...] Use -h to see extended help
-w <WINDOW> size of the window used for caching. Make sure this is greater than the read size
default: 10000
-W <THREAD-WINDOW> size of the window used per thread
default: 100000
実行方法
call-1メソッドは、リファレンス配列に対してバリアントをコールする。MDフィールドを出すアライナー（BWAなど）を使う必要がある。
java -jar jacusa2.jar call-1 -r results_call1.out -p 12 alignments.bam
- -p use # THREADS
- -r results are written to RESULT-FILE
call-2メソッドは、2つの条件でバリアントを同定する。
java -jar jacusa2.jar call-2 results_call2.out condition1.bam condition2.bam
- JACUSA2helper JACUSA2出力のダウンストリーム解析をサポートするRのヘルパーの新しいバージョン。アーテファクトのフィルタリングなどを行う。
引用
RNA modification mapping with JACUSA2
Michael Piechotta, Isabel S. Naarmann-de Vries, Qi Wang, Janine Altmüller & Christoph Dieterich
Genome Biology volume 23, Article number: 115 (2022)