メタゲノム由来のアミノ酸配列データの増加は、タンパク質の機能、微生物の多様性、進化的関係に対する我々の理解を大きく変えた。しかし、これらのタンパク質の大部分は依然として機能的に未解明である。このような未解明配列を、少数の実験的に機能が確認された配列とグループ化することで、アノテーションを転移することが可能になる。また、多重配列アライメントによって保存された残基を調べることで、既存の機能情報がなくても、機能の手がかりを得ることができる。このデータ量の急増と配列のグループ化の必要性に対応するために、本著者らはスケーラブルでオープンソース、かつパラメータ設定可能な Nextflow パイプライン（nf-core/proteinfamilies）を提案する。このパイプラインは、新規タンパク質ファミリーを生成するか、新しいタンパク質を既存のファミリーに割り当てることができる。計算ベンチマークでは、リソース使用量が入力サイズにほぼ線形でスケールすることが示され、また生物学的ベンチマークでは、生成されたタンパク質ファミリーが広く使われているデータベースの手動でキュレーションされたファミリーと密接に類似していることが示された。
以下の流れで進められる。
１、入力タンパク質配列の品質チェック
２、タンパク質ファミリーの作成
シーケンスクラスタリング（MMseqs2）
MSA実行（FAMSAまたはmafft）、オプションで、MSAのギャップ部分のクリップ（ClipKIT）
たんぱく質ファミリーのHMMを生成し、追加のシーケンスをファミリーに組み込む（hmmer）。オプションで、ファミリー代表シーケンスをファミリーモデルと比較して重複ファミリーを削除（hmmer）オプションで、残ったファミリーから、MMseqs2を使用して厳密なクラスタリングを行い、ファミリー内の重複シーケンスを除去し、クラスタ代表シーケンスを保持。さらにオプションで、ファミリー内の重複が除去されていない場合、HH-suite3を使用して.sto形式のフルMSAを.fas形式に再フォーマットする
ファミリーサイズ分布と代表シーケンスの長さの統計情報を表示（MultiQC）
３、ファミリーのアップデート
入力シーケンスを既存のファミリーモデル（hmmer）と比較して、更新対象のファミリーを特定
ヒットしないシーケンスの場合、上記の手順を継続
インストール
$ nextflow run nf-core/proteinfamilies --help
N E X T F L O W ~ version 25.04.6
Launching `https://github.com/nf-core/proteinfamilies` [adoring_lalande] DSL2 - revision: 4b8c2c06c3 [main]
------------------------------------------------------
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|\ | |__ __ / ` / \ |__) |__ } {
| \| | \__, \__/ | \ |___ \`-._,-`-,
`._,._,'
nf-core/proteinfamilies 1.3.0
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Typical pipeline command:
nextflow run nf-core/proteinfamilies -profile <docker/singularity/.../institute> --input samplesheet.csv --outdir <OUTDIR>
--help [boolean, string] Show the help message for all top level parameters. When a parameter is given to `--help`, the full help message of that parameter will be printed.
--help_full [boolean] Show the help message for all non-hidden parameters.
--show_hidden [boolean] Show all hidden parameters in the help message. This needs to be used in combination with `--help` or `--help_full`.
Input/output options
--input [string] Path to comma-separated file '.csv' containing information about the samples in the experiment.
--outdir [string] The output directory where the results will be saved. You have to use absolute paths to storage on Cloud infrastructure.
--email [string] Email address for completion summary. Example: name.surname@example.com
--multiqc_title [string] MultiQC report title. Printed as page header, used for filename if not otherwise specified.
Generic options
--multiqc_methods_description [string] Custom MultiQC yaml file containing HTML including a methods description.
Clustering parameters
--save_mmseqs_db [boolean] Save the db output folder of mmseqs createdb
--clustering_tool [string] Choose clustering algorithm. Either simple 'cluster' for medium size inputs, or 'linclust' for less sensitive clustering of larger datasets. (accepted: linclust, cluster)
--cluster_seq_identity [number] mmseqs parameter for minimum sequence identity [default: 0.5]
--cluster_coverage [number] mmseqs parameter for minimum sequence coverage ratio [default: 0.9]
--cluster_cov_mode [integer] mmseqs parameter for coverage mode: 0 for both, 1 for target and 2 for query sequence [default: 0]
--save_mmseqs_clustering [boolean] Save the clustering output folder of mmseqs cluster or linclust
--cluster_size_threshold [integer] Minimum clustering chunk size threshold to create seed Multiple Sequence Alignments upon. [default: 25]
--save_mmseqs_chunked_fasta [boolean] Save membership-filtered initial mmseqs clusters in fasta format
Alignment parameters
--alignment_tool [string] Choose alignment tool. FAMSA is recommended as best time-memory-accuracy combination option. (accepted: famsa, mafft)
--clipkit_out_format [string] Choose the output format of the clipped alignment. [default: clipkit]
--trim_ends_only [boolean] Choose if ClipKIT should only clip gaps at the ends of the MSAs. [default: true]
--gap_threshold [number] Multiple Sequence Alignment (MSA) positions with gappiness greater than this threshold will be trimmed [default: 0.5]
--hmmsearch_evalue_cutoff [number] hmmsearch e-value cutoff threshold for reported results [default: 0.001]
--save_hmmsearch_results [boolean] Save the output of hmmsearch (.domtbl.gz and .tbl.gz)
--hmmsearch_query_length_threshold [number] hmmsearch minimum length percentage filter of hit env vs query length [default: 0.9]
--save_hmmsearch_filtered_fasta [boolean] Save family fasta files after recruiting sequences with hmmsearch
Redundancy removal parameters
--hmmsearch_family_length_threshold [number] hmmsearch minimum length percentage filter of hit env vs query length, for redundant family removal [default: 0.9]
--save_non_redundant_fams_fasta [boolean] Save only the fasta files of non-redundant families (might still contain redundant sequences)
--cluster_seq_identity_for_redundancy [number] mmseqs parameter for minimum sequence identity [default: 0.9]
--cluster_coverage_for_redundancy [number] mmseqs parameter for minimum sequence coverage ratio [default: 0.9]
--cluster_cov_mode_for_redundancy [integer] mmseqs parameter for coverage mode: 0 for both, 1 for target and 2 for query sequence [default: 0]
--save_non_redundant_seqs_fasta [boolean] Save the final family fasta files with sequence redundancy removed
!! Hiding 24 param(s), use the `--show_hidden` parameter to show them !!
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* The pipeline
https://doi.org/10.5281/zenodo.14881993
* The nf-core framework
https://doi.org/10.1038/s41587-020-0439-x
* Software dependencies
https://github.com/nf-core/proteinfamilies/blob/main/CITATIONS.md
テストラン
分類するタンパク質のfasta配列とそのパスを書いたサンプルシートが必要｡
1列目: サンプル名
2列目: アミノ酸 fasta配列ファイルへのパス（ .faa や .fa）ここではweb上のファイルをURLで指定
3列目: existing_hmms_to_update - 任意で既存の HMM を指定
4列目: existing_msas_to_update - 任意で既存の MSA を指定する
MGnify由来の小さな配列セットが使われている｡
テストランならレポジトリをcloneしてそのまま実行する｡fastaはweb上のファイルを使っている｡
git clone https://github.com/nf-core/proteinfamilies.git
cd proteinfamilies
nextflow run nf-core/proteinfamilies -profile test,docker --outdir test
出力例
出力
https://nf-co.re/proteinfamilies/output
入力アミノ酸配列の基本統計､クラスタリング結果､シードのMSA､HMM生成およびサーチ結果､冗長性除去､既存ファミリー更新､代表配列抽出とレポート作成が行われる｡
その他（論文より）
- タンパク質配列の数が増加するにつれ、タンパク質ファミリーの大量の手動キュレーションは現実的ではなくなってきている。タンパク質ファミリーを自動的に生成する計算機手法は、感度、スケーラビリティ、および使いやすさのバランスを保つ必要がある。Pfam-Bは、Pfam のプロファイル HMM に基づくファミリーを補完する、計算機で生成された仮説的なタンパク質ファミリーの集合である。Pfam-Bファミリーは、非常に高速なシーケンスクラスタリングツールである双方向MMseqs2クラスタリングを基盤としており、Pfamの主要なリリースごとに再計算されているが、他のシーケンスへの転用は容易ではない。もう1つの広く使用されているクラスタリングツールはCD-HITで、MMseqs2と同様に、より長いシーケンスのgreedy incremental clusteringを採用することで速度を優先している。しかし、MMseqs2とCD-HITはプロファイルHMM手法に比べて感度を犠牲にし、追加のシーケンスにファミリー注釈を転送する際にもいくつかの課題を抱えている。したがって、大規模で継続的に拡大するシーケンスデータセットからタンパク質ファミリーを生成し維持するための、効率的でスケーラブルなソリューションが求められている。proteinfamiliesパイプラインは、シーケンスのクラスタリング、タンパク質ファミリーレベルのモデル、アラインメント、メタデータの生成、重複の除去、および新たなシーケンスが追加されるにつれてファミリーを更新するモジュールを連鎖させることで、これらの課題を解決する。
引用
nf-core/proteinfamilies: A scalable pipeline for the generation of protein families
Evangelos Karatzas, Martin Beracochea, A. Baltoumas, Eleni Aplakidou, Lorna Richardson, James A. Fellows Yates, Daniel Lundin, nf-core community, Aydin Buluc, Nikos Kyrpides, Ilias Georgakopoulos-Soares, Georgios A. Pavlopoulos, Robert D. Finn
bioRixv, Posted August 16, 2025.
*1 javaを11から17に更新した
sudo apt update
sudo apt install openjdk-17-jdk
java -version
export JAVA_HOME=/usr/lib/jvm/java-17-openjdk-amd64
export PATH=$JAVA_HOME/bin:$PATH
java -version
#nextflow最新版
curl -fsSL https://get.nextflow.io | bash
./nextflow -version
=> パスの通ったディレクトリに移動
