macでインフォマティクス

macでインフォマティクス

NGS関連のインフォマティクス情報についてまとめています。

MinIONでシーケンスを行う

随時更新

 

MinION(ミナイオン)でシーケンスする流れを説明する。

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ナノポアに関しては模索中の段階です。書いていることが必ずしも正しいとは限らないことに注意してください。

 

wiki

MinION (Oxford Nanopore) - wiki

 

 

追記

動画マニュアルリンク削除 & HTMLマニュアルについて追記

 

公式のリンクをいくつか貼っておく。

White papers

https://nanoporetech.com/resource-centre/white-papers

Videos

https://nanoporetech.com/resource-centre/videos

Posters

https://nanoporetech.com/resource-centre/posters

London Calling 2017

https://nanoporetech.com/events/ncm17/watch

London calling 2018 (2018 5/24-5/25)(動画のほか、ダウンロード可能なposterもアップされています)

https://londoncallingconf.co.uk/lc18

Rapid Lambda Control Experiment (SQK-RAD004) protocol PDF

https://store.nanoporetech.com/media/wysiwyg/Rapid_Lambda_Control_Experiment_SQK-RAD004_.pdf

DNA extraction protocol

https://community.nanoporetech.com/extraction_methods

 

MinKnowがversion2になっているようです。

ハッシュタグ #MinKnow2(リンク)。

 

 

2018 3/27 追記 3/27に登録されたPreprintです。樹木(Eucalyptus pauciflora)を材料にしています。DNA抽出とライブラリ調整前に読むべき内容です。

A comprehensive toolkit to enable MinION sequencing in any laboratory

https://www.biorxiv.org/content/biorxiv/early/2018/03/27/289579.full.pdf

 

2017年10月現在、フローセル2個とrapid sequencing用の試薬が全て入ったお得なStarter kitを購入することができる。Rapid sequencing kitはLigation seqeucing kitよりスループットは劣るが(Ligation seqeucing kitの70-80%くらい出る)、トランスポザーゼでDNAを処理してアダプターをつけることで、ライブラリ調整を10分程度で行うことができる(PCR必要なし)。starter kitを購入すれば、追加投資がなしにシーケンスを行うことができる(後で記載したUSB3.0 typeCのケーブルは別途必要かも )。

https://store.nanoporetech.com/rapid-sequencing-kit.html

Rpaid sequencingには、DNAを500~1000ngくらい抽出しておく必要がある。DNAがあまり取れない生物では、これはデメリットになる。もう1つ注意点として、starter kitについてくるフローセルはR9.4の1D専用フローセルで変更不可のようである(未確認)。よりハイクオリティな2D(1Dx2)シーケンスを行うには、R9.5のフローセル(リンク)を購入する必要がある。また、オックスフォードナノポア社では、Minion以外のPromethIONやGridIONなどのシーケンサーも選択できる。ゲノムサイズが大きければこれらを選ぶのも手であるし、フローセルをまとめ買いすると少し安くなる様なので、Minionで十分量読むまでひたすらシーケンスする選択もあるかもしれない。

 

シーケンス精度の変化(平均と中央値)。

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From squiggle to basepair: computational approaches for improving nanopore sequencing read accuracy (Franka J. Rang et al, 2018)より。

 

MinionをつなぐMACWindowsのハードウエアチェック

https://nanoporetech.com/community/lab-it-requirements

必要な実験器具(外でやるなら工夫する必要がある)

https://nanoporetech.com/sites/default/files/s3/rapid-sequencing-requirements.pdf

MACやPCの設定

https://nanoporetech.com/sites/default/files/s3/MinION-Computer-Requirements-March-17_Final.pdf

 

 

DNA抽出

DNAの抽出は、コストを気にしないならカラムを使った方法が良いと思われる。例えば、Pacbioでは

などを推奨しているが、nanoporeでもこれらのキットが使える(*1)。ただし動物、植物、昆虫、真菌、バクテリア、ウィルスなど生物により夾雑物の種類は変わるので、一概には言えない。初めてナノポアを使うなら、論文をいくつか読んで、パフォーマンスが良さそうな方法を調べておいた方が良い。DNAが汚いと、全然読めない可能性もある(本当は失敗した方法が知りたいが、そういったデータは論文にならない)。

追記 上にもリンクを載せたが、ヒト、ブタ、ウサギの血清、Spinach、yeast、E.coliなどの DNA Extraction methodsのPDFがダウンロードできる。

https://community.nanoporetech.com/extraction_methods

E.coliなら、 O.D0.5でクロラムフェニコール入れて1時間培養し、QIAGEN Genomic-tip 500/G でDNA抽出。Minionの出力は8Gb/48h。リード長は下(公式より転載)。

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コストを気にするなら、磁気ビーズを使った高分子量gDNA抽出プロトコルも報告され始めている。

 

追記

まずこれを読む。大変勉強になる。

http://lab.loman.net/2018/05/25/dna-extraction-book-chapter/#__RefHeading___Toc505877554

 

追記 Protocols.ioにDNA抽出プロトコルが上がっています。

1、

High purity, high molecular weight DNA extraction from rust spores via CTAB based DNA precipitation for long read sequencing protocol by Ramawatar Nagar

2、

High molecular weight gDNA extraction after Mayjonade et al. optimised for eucalyptus for nanopore sequencing protocol by Miriam Schalamun

3、

https://www.protocols.io/view/high-quality-dna-from-fungi-for-long-read-sequenci-k6qczdw

4、

Nuclear DNA purification from recalcitrant plant species for long-read sequencing protocol by Ashley Jones

 

5、ONT HPのExtraction methods(log inしておく必要あり。プロトコルのPDFをダウンロードできる)

https://community.nanoporetech.com/extraction_methods

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 6、High Molecular Weight DNA Extraction from Recalcitrant Plant Species for Third Generation Sequencing 

7、Ultra-long Read Sequencing for Whole Genomic DNA Analysis

 8、2019 9/29

High molecular weight DNA isolation method from diverse plant species for use with Oxford Nanopore sequencing

 

 

 

DNAの純度

Minionのシーケンスにはハイクオリティなlong DNAが必要である。

Oxford Nanopore社のHPに記載されているCriteriaを載せておく。

  • Purity as measured using Nanodrop - OD 260/280 of 1.8 and OD 260/230 of 2.0-2.2
  • Average fragment size, as measured by pulse-field, or low percentage agarose gel analysis >30 kb
  • Input mass, as measured by Qubit - 10 pg
  • No detergents or surfactants in the buffer

DNAの定量は、low bind tubeに溶かし、Qubitなどの蛍光法により行う。Nanodropなどを使った260nmの測定はRNA、NTP、ごく微量のフェノールなど様々な夾雑物に影響を受けるため、はっきり言って全くあてにならない。夾雑物が疑われるなどの理由でDNA抽出後に追加精製を行うなら、Pacbioのガイドで勧められているフナコシのPowerClean DNA Clean-Up Kitなどが良いかもしれない。土壌サンプル向けのカラムキットで多糖類や腐食酸も除けるようである。

追記 上にリンクを貼ったprepirntでは、260/230が"1程度"の低いサンプルは、シーケンススループット1桁くらい落ちている(Preprint 表1)。

 

2019 6/19 追加

London Calling 2019: Stella Loke

Optimising Plant DNA extraction for nanopoe sequencing

 

 

DNAの長さ

長い切れていないDNAを抽出できれば、それだけ長いDNAを読む率が長くなる。カビのゲノム解析のペーパー(リンク)では、ゲノム抽出後にBlue Pippinでサイズセレクションすることで、平均サイズが大きく向上したと報告されている。また、このサイズセレクションを行うタイミングは、ゲノムをとった後でなくライブラリ調整後がベストらしい(Omics! Omics!: Nanopore Workshop Notes)。Blue Pippinは国内では日本ジェネティクス社から買えるようである(リンク)。大崎さんのBlue Pippin解説(リンク)。

高分子のDNAを回収するには、DNAの調整時の取り扱いも細心の注意を払う必要がある。ナノポアHPには以下のように記載されている。

  • Using wide-bore pipette tips to handle the gDNA
  • Mixing gently but thoroughly by inversion, as opposed to vortexing or pipetting
  • Avoiding unnecessary freeze-thaw cycles
  • Avoiding pH <6 and >9
  • Avoiding high temperatures, which can lead to degradation

特に抽出後の確認の電気泳動でゲノムがスメアになっているようなサンプルは使うべきではない。

追記

カラムを使わず低コストに高分子量genomic DNAを抽出する方法

Extraction of high-molecular-weight genomic DNA for long-read sequencing of single molecules

https://www.future-science.com/doi/full/10.2144/000114460#

 

キットのプロトコル

https://community.nanoporetech.com/protocols 

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2019 1/11 追記

追加精製

どのような技術でDNA抽出したとしても、ラン前にSPRI技術で追加精製して2kb以上のDNA断片をエンリッチすることで、より効率的なシーケンシングが可能になります。詳細は、上にリンクを載せたExtraction methodsの、SPRI size selection protocol for >1.5-2 kb DNA fragmentsを確認して下さい。以下のHPも参考になります。 

https://albertsenlab.org/all-i-want-for-christmas-is-a-terabase-of-nanopore-data/

 

2019 9/13 

publishから時間が経ってますが、以下の論文にはシーケンシングを成功させるノウハウが詰まっています。植物を使っている人以外も読んだ方がいいと思います。

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/1755-0998.12938

 

ラン

簡単に流れを載せておきますが、Oxfordナノポアのシーケンス技術はコミュニティベースで進化し続けています。ラン前にプロトコルがバージョンアップしていないか、MinKNOWのアップデートはないか確認しておいて下さい。

https://store.nanoporetech.com/media/wysiwyg/Rapid_Lambda_Control_Experiment_SQK-RAD004_.pdf

 

0、ソフトウエアのインストール

log inしてから右側のsoftware Downloadsを選択。

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端末で動くGuppyやAlbacoreもダウンロードできる。

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1、ライブラリ調整

1DのR9.4フローセルのRAD-003のプロトコルに従う。~400 ng DNAを7.5µlのボリュームで用意する必要がある。

追記: input DNA量についても、上のPrepirntが詳しく触れられている。DNA repair and end-prepは、0.2pmolのDNAに対して最適化されていると書かれており、これは平均8kbの2本鎖DNAだと1ugになる。平均24kbだと3ugになる(Sequencing library preparationtyより)。

 

2、フローセルの準備。

フローセルを冷蔵庫から取り出し、ダミーセルと交換する。

 

3、ソフトの立ち上げ 

MinionをつなぐPCから専用ソフトのMinKNOWを立ち上げる。MinKNOWは購入者のログインページから検索すれば見つかるので、前日までにインストールしておく。

MinKNOW立ち上げ時、ホストマシンはネットに接続して、さらにUSB3.0を介してMinionをつないでおく必要がある。

 

我々だけかもしれないが、MinionのUSB3.0 CタイプポートとPCをつなぐUSB3.0のケーブルが同封されていなかった(間違いでしたらすみません)。

修正 ↓入ってます。

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初めにQCを行う。

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3、サンプルの投入。

ランの手順はナノポア公式ページに動画で説明されている(購入者アカウントでログインして、以前は右上の検索ウィンドウから"Priming the SpotON Flow Cell Print step"で検索)説明動画(写真のキャプチャ)にリンクしていたが、2018年3月に確認したところ、HTMLマニュアルに切り替わっていた。

Minionのページからマニュアルのリンクに飛ぶことができる(Log inしている必要あり)。そこではランニング手順が記載されている。

3-1~

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f:id:kazumaxneo:20180313144420j:plain

5-1

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f:id:kazumaxneo:20180316133650j:plainこの後もHTML manualは続いている。公式ではlambdaを使っているが、サンプルも同様の手順でランできる。

 You tubeに動画があったのでそれを載せておく。

 

ポートは弁の役割も果たしているので、動画の順番通りに進める必要がある。我々はををランを一回止めてサンプルを途中で追加投入する際に、priming portを開けてなかったためサンプルがうまくロードできなかった(吸い戻してなんとかリカバーした)。

 Live base callを選択すると、リアルタイムで徐々にfast5からfastqに変換してくれる。ただしこれには時間がかかる様である。

 

ラン前。

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poreの活性を表示する画面(数時間後)。

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こちらはラン10分後のリード長分布。

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時間とともに、長いリードも増えてくる。 

 

36時間ラン後。まだいくつか緑のセルがある。

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48hランすると数万リード得られる。ただしサイズ分布によってリード数は当然変わってくるので、ライブラリによってリード数は大きく変わってくる。(ロングを1-2万読んだデータと、100bp以下のジャンク(10-20%エラーを含むショートリード)をたくさん含む10万リード(5倍)、どっちがアセンブルに有利だろうか)。

 

 

 

ポアの色は以下のように説明されている。

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f:id:kazumaxneo:20171006163607j:plain

f:id:kazumaxneo:20171006163627j:plain

f:id:kazumaxneo:20171006163631j:plain

f:id:kazumaxneo:20171006163638j:plain

f:id:kazumaxneo:20171006163644j:plain

f:id:kazumaxneo:20171006163654j:plain

f:id:kazumaxneo:20171006163702j:plain

f:id:kazumaxneo:20171006163709j:plain

f:id:kazumaxneo:20171006163713j:plain

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  •  ラン中のポアは、まずAdapterの黄色になり、それからしばらくすると緑のポアに変わっていく(時折だが一瞬色が変わることもある)。リードが取り込まれてアダプターから徐々にDNAが読まれているからと考えられる。
  • 黒色は完全にダメになったポアである。また、オレンジも1つの区画に複数ポアがあるもので、信号が混在してしまい利用できないセルとなる。
  • 青いセルも出てないセルである。ただし、途中でサンプルを追加投入すると青の区画も緑に戻るものがいくつかあった。完全にダメなセルではないらしい(未確認)。
  • データは指定したディレクトリにどんどん追加されていく。他の方の情報によると、4000リードくらい読むと次のフォルダに切り替わるらしい。48hランすると、いくつかのフォルダができることになる。

公式HPの説明を貼っておく。

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追記

Miriam Schalamunさん達のPreprinrtで、"ratio of ‘in strand’ (light green) to the sum of ‘in strand’ plus ‘single pores"を最初の数時間評価し、占有率が悪い時はwashすることを述べている(図8より)。

 

コマンドラインで動く basecallerもいくつか発表されています。albacoreとguppyはoxford nanoporeのオフィシャルbasecallerです。

 

スループット

ポアの活性やサンプル品質に大きく左右されるので一概には言えないが、読み取り速度は450bpsに調整されているらしい。ここでは2G出力されたと報告されている。また、ヒトゲノムをアセンブルしたという報告では39台のMinionを使い、トータル14,183,584 リード得て、トータル長は91,240,120,433 baseだったと述べられている(30x)。ということは、1台あたり平均363681リードで2.3Gb (23億)読んだことになる。データの大半はLigation kitで構築されたライブラリ由来らしい。本当なら素晴らしいスループットである。また、Nanopore R9 rapid run data release · Loman Labsでも1Dで2G、2Dで0.6G読めたと報告している。

ただし、http://seqanswers.com/forums/showthread.php?t=71774では0.5Gに達しなかったという話もある。SRAに登録されているデータを見ると、さらにばらつきが多い。この登録データでは7台のMinionを使っているようだが、スループットに大きな開きがある(バーコードシーケンスと書かれていないが、もしかしてバーコードシーケンス?)。

また日本でシーケンンスする場合、イギリスで作られて発送されるため、shippingで2週間くらいはどうしてもかかってしまう。その影響はどれくらいあるのだろうか?(早く届くこともあります。前回頼んだ時は1/24に注文して1/28にshipping、30に届きました)。

 

上記のリンクのLoman labでは、E.coliを1Dと2Dで読んだデータを公開してくれています。興味がある人はアクセスしてみてください。中盤のリンクから1Dと2Dのfast5データと、変換済みfastaがダウンロードできます (fast5は200~300GBくらいあります)。

Nanopore R9 rapid run data release · Loman Labs

 

追記

1、2018年3月に知り合いが行ったシーケンスでは、3.2Gbと6.1Gb読めていました(raw fastq)。

 2、https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5803254/

この論文ではONT Ligation Sequencing Kitで調整したシロイヌナズナゲノムをMinionでシーケンスして3.4Gbの base callを得ています。200kb以上のリードも4本得られたと書かれています。miniasmなどでアセンブルするのが構造変化を検出するためにシンプルで最短の方法だと結論付けています。

3、上にもリンクを貼ったPreprint(リンク)では 、R9.5で安定して6-8Gb読めています。

4、複数のbacteria菌株のシーケンスとアセンブリパフォーマンス比較。MiseqとMinionのハイブリッドアセンブリを行なっている。bacteriaのロングリードシーケンシングでどのくらい読めばいいか参考になる。

https://www.biorxiv.org/content/biorxiv/early/2018/07/05/362673.full.pdf

 

 

 

 

まとめ 

ナノポアのシーケンスに求められるのは"長さ"である。リード数が少なめでも、リピートをカバーできるだけのロングリードが読めていれば、その分だけアセンブルにとって有利になるし、ライブラリ中に1000bp以下の分子のコピー数が多く残っていれば、どれだけリードがたくさん読めていても、アセンブルのcontiguityの改善には限界がある。いかに切れていない綺麗なDNAを抽出してランできるかが結果を左右する。

 

 参考資料

Sample preparation and DNA extraction in the field for nanopore sequencing · Loman Labs

 

http://seqanswers.com/forums/showthread.php?t=21280

 

http://seqanswers.com/forums/showthread.php?t=76021

 

2016年nanopore ワークショップに参加した研究者の方の記事

Omics! Omics!: Nanopore Workshop Notes

 

SSDの容量について(ログインが必要)

https://community.nanoporetech.com/posts/is-260gb-of-disk-space-eno

 

R9スループット

http://lab.loman.net/2016/07/30/nanopore-r9-data-release/

 

 

追記 2018 09/25

Oxford Nanopore Technologiesの宮本さんが、ブログにアセンブリとSV検出の流れをアップされています。


ナノポアシーケンサーMinIONインプレッション

ナノポアシーケンサーMinIONインプレッション | 酵母とシステムバイオロジー

 

追記 2018 10/06

MinIONとGridIONのフローセルが新しくなったようです。読み込み速度が強化され、耐久性も72hに伸び、アナウンスによると30Gbのyieldが期待できるようです。

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Oxford Nanopore releases ‘Rev D’ flow cells, enabling increase in data yields 

 

追記 2018 10/23

Nanoporeには様々なbasecallerがありますが、Ryan Wickさんがbasecallerを変えた時の違いを調べてまとめられています。

base call時点で大きな違いが出ていますが、nanopolishでmethylation-aware オプション付きでpolishingする限り、polish後の配列のエラー率に差はほぼなくなるようです。

 

*1

Nanopore公式ページで、枯草菌から複数のキットでDNA抽出してシーケンシングした時のフラグメントサイズ結果が掲載されている。使っているのは、QIAGEN Genomic-tip 500/G、QIAGEN MagAttract HMW DNA Kit、Circulomics Nanobind DNA Kit、QIAGEN Puregene Yeast/Bacteria Kit bになる。シンプルなワークフローで高分子DNAが十分に回収できるMagAttractか、とにかくより高分子DNAが取れるPuregene Yeast/Bacteria Kit(ただし収量が少ない)の使用が推奨されている。また、いずれの方法でも、シーケンシング前にSPRI技術を使ったサイズセレクトを行うことが推奨されている(参考)。(生物によっては、この方法だけで高分子gDNAが取れるとは限らないことに注意してください。細胞壁の破砕、エンドヌクレアーゼの不活性化、不純物によるカラム目詰まり、など想定しておくことはたくさんあり得ます)。

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Nanopore公式ページより転載。やりすぎると非常に短いプラスミドも消える可能性があります。実験の目的に合わせて考えて下さい。

 

ロングリード関連のツール

 

2019 3/2追記

面白いものが出てますね。原理は不明ですが低分子DNAを除去できるようです。

https://community.nanoporetech.com/posts/circulomics-short-read-eli

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追記

この試薬に限らず当たり前の話ですが、処理することでかなりモル数は減ります。処理後ナノポアでランできるできるだけのDNAを想定して使わないと量が減って失敗します。ご注意ください。

 

 

2019 3/10追記

日本ゲノム微生物学会 ニュースレターMinION Q&A(16ページ)

https://www.sgmj.org/pdf/newsletter/sgmj_no17.pdf

 

Stack Exchange  --Bioinformatics--

Questions tagged [nanopore]

https://bioinformatics.stackexchange.com/questions/tagged/nanopore

 

2019 3/15追記

ついに出てきましたね。

 

2019 3/18

Flongleが買えるようになりましたね、MinIONかGridIONのデバイスに取り付けて、MinIONより小スケール(126チャネルでMinION の512ポア相当)でランできます。値段は日本円でおよそ60万くらいで、48フローセル付いていて、1年間で小分け出荷できるようです(要確認)。1本あたり110米ドルくらいの計算で、16S/18Sアンプリコンやスモルーゲノムシーケンシングに適してそうですね。そのうちイールドの報告も出て来ると思いますのでtwitterチェックしておきましょう。

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2019 6/6

マーケティング上の理由なのかイールドが足りないのが理由はよくわかりませんが、Flongleが12パックでも購入できるようになってますね。

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 その後、1−2個から購入可能になっています。

 

知人がフロングルについて問い合わせた時の回答  

Flongleのフローセルと、MinIONで使用するフローセルとの違い

フロングルは

・126チャネル(MinIONは512)

・フロングルランタイム:約16-24時間

・フロングルフローセルの前にCTCとアダプターが送付される

・フロングルフローセルは一回使用のみで返却の必要なし

・MinION/GridIONのみに使用可能

・9.4.1ポア(1D2キットとは使用不可)

・使用期限:4週間

・保存温度:通常のフローセルと同様

・推奨温度と使用期限を守り、使用前のQCポア数60以下だった場合交換対応

・ Flow cellで1.8Gb記録(22時間ラン)

・アダプターはのちにストアにて販売予定だが、現在必要な場合はフロングルのスターターパックを再度購入する。

 

7/5 Protocol.ioにmicroalga向けのDNA抽出プロトコルが上がってます。


2019 8/21 

Nanopore Day, Tokyo に関するツイート

 

Nanopore Day, Tokyoに行った人から聞いた話を2点追記。話半分で聞いてください。

  • DNAが減ってきてDNAがない状態で電荷がかかり続けると、ポアが早く傷んでしまう。よって減ってきたら素早くウオッシュし、DNAを追加する。これを繰り返すことでシーケンスイールドを上げることができる(=48h放置は良くない)。
  • 良くなっているが、R10は結構厳しい。dual channel?で読んでいるが、まだ発展途上。(当たり前だが)TGSの問題であるホモポリマーシーケンスエラーは解決していない。

 

#GenomeScience2019 - Twitter Search

 

Rocky Mountain adventures in Genomic DNA sample preparation, ligation protocol optimisation / simplification and Ultra long read generation

Rocky Mountain adventures in Genomic DNA | Long read club

 

 

R10のパフォーマンス

http://albertsenlab.org/ar10e-we-there-yet/

 

 Fire Monkey HMW DNA extraction

https://revolugen.co.uk/revolugens-dna-extraction-technologies/

良さそうですね。 

 

今年すでに何度か開催されている、はじめてみよう!MinIONセミナー、が以下の日時と場所で開催されるようです。

2019年 12月13日(金)14:30~16:00
場所:東京都中央区日本橋本町2-3-11
日本橋ライフサイエンスビルディング B1F B103会議室

費用:無料

定員30名程度

これからMinIONをご利用される方、また利用をご検討されている皆様向けに製品の原理と概要、ご利用にあたっての注意点を1時間30分程度でご紹介いたします。 

とのことです。

 

これとは別に、有償のワークショップもあります。次回は東京開催のようです。

https://store.nanoporetech.com/catalog/product/view/id/272/category/25?utm_campaign=Japan&utm_source=hs_email&utm_medium=email&utm_content=78612458&_hsenc=p2ANqtz-9dROSHJK9PwRT-bJXwW-NMnGJEZIZqRM1PBhRsxgrdC9InGRun92TAYLC93C4bkATBrEgavzrPY2OtcoKgSBcoPTu25aXBMyZJ-Tv6BmIREd0JG98&_hsmi=78636051

 

2019 12/6追記