macでインフォマティクス

macでインフォマティクス

HTS (NGS) 関連のインフォマティクス情報についてまとめています。

MinIONでシーケンスを行う

1随時更新

 

MinION(ミナイオン)でシーケンスする流れを説明する。

 f:id:kazumaxneo:20171006192519j:plain

ナノポアに関しては模索中の段階です。書いていることが必ずしも正しいとは限らないことに注意してください。

 

wiki

MinION (Oxford Nanopore) - wiki

 

公式ツイッター

 

LONDON CALLING 2022



TOPICやPRESENTATION TYPEでスピーカーの絞り込みが可能

 

追記

動画マニュアルリンク削除 & HTMLマニュアルについて追記

 

公式のリンクをいくつか貼っておく。

White papers

https://nanoporetech.com/resource-centre/white-papers

Videos

https://nanoporetech.com/resource-centre/videos

Posters

https://nanoporetech.com/resource-centre/posters

London Calling 2017

https://nanoporetech.com/events/ncm17/watch

London calling 2018 (2018 5/24-5/25)(動画のほか、ダウンロード可能なposterもアップされています)

https://londoncallingconf.co.uk/lc18

Rapid Lambda Control Experiment (SQK-RAD004) protocol PDF

https://store.nanoporetech.com/media/wysiwyg/Rapid_Lambda_Control_Experiment_SQK-RAD004_.pdf

DNA extraction protocol

https://community.nanoporetech.com/extraction_methods

  

2018 3/27 追記 3/27に登録されたPreprintです。樹木(Eucalyptus pauciflora)を材料にしています。DNA抽出とライブラリ調整前に読むべき内容です。

A comprehensive toolkit to enable MinION sequencing in any laboratory

https://www.biorxiv.org/content/biorxiv/early/2018/03/27/289579.full.pdf

 

2017年10月現在、フローセル2個とrapid sequencing用の試薬が全て入ったお得なStarter kitを購入することができる。Rapid sequencing kitはLigation seqeucing kitよりスループットは劣るが(Ligation seqeucing kitの70-80%くらい出る)、トランスポザーゼでDNAを処理してアダプターをつけることで、ライブラリ調整を10分程度で行うことができる(PCR必要なし)。starter kitを購入すれば、追加投資がなしにシーケンスを行うことができる(後で記載したUSB3.0 typeCのケーブルは別途必要かも )。

https://store.nanoporetech.com/rapid-sequencing-kit.html

Rpaid sequencingには、DNAを500~1000ngくらい抽出しておく必要がある。DNAがあまり取れない生物では、これはデメリットになる。もう1つ注意点として、starter kitについてくるフローセルはR9.4の1D専用フローセルで変更不可のようである(未確認)。よりハイクオリティな2D(1Dx2)シーケンスを行うには、R9.5のフローセル(リンク)を購入する必要がある。また、オックスフォードナノポア社では、Minion以外のPromethIONやGridIONなどのシーケンサーも選択できる。ゲノムサイズが大きければこれらを選ぶのも手であるし、フローセルをまとめ買いすると少し安くなる様なので、Minionで十分量読むまでひたすらシーケンスする選択もあるかもしれない。

 

シーケンス精度の変化(平均と中央値)。

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From squiggle to basepair: computational approaches for improving nanopore sequencing read accuracy (Franka J. Rang et al, 2018)より。

 

MinionをつなぐMACWindowsのハードウエアチェック

https://nanoporetech.com/community/lab-it-requirements

必要な実験器具(外でやるなら工夫する必要がある)

https://nanoporetech.com/sites/default/files/s3/rapid-sequencing-requirements.pdf

MACやPCの設定

https://nanoporetech.com/sites/default/files/s3/MinION-Computer-Requirements-March-17_Final.pdf

 

 

DNA抽出

DNAの抽出は、コストを気にしないならカラムを使った方法が良いと思われる。例えば、Pacbioでは

などを推奨しているが、nanoporeでもこれらのキットが使える(*1)。ただし動物、植物、昆虫、真菌、バクテリア、ウィルスなど生物により夾雑物の種類は変わるので、一概には言えない。初めてナノポアを使うなら、論文をいくつか読んで、パフォーマンスが良さそうな方法を調べておいた方が良い。DNAが汚いと、全然読めない可能性もある(本当は失敗した方法が知りたいが、そういったデータは論文にならない)。

追記 上にもリンクを載せたが、ヒト、ブタ、ウサギの血清、Spinach、yeast、E.coliなどの DNA Extraction methodsのPDFがダウンロードできる。

https://community.nanoporetech.com/extraction_methods

E.coliなら、 O.D0.5でクロラムフェニコール入れて1時間培養し、QIAGEN Genomic-tip 500/G でDNA抽出。Minionの出力は8Gb/48h。リード長は下(公式より転載)。

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コストを気にするなら、磁気ビーズを使った高分子量gDNA抽出プロトコルも報告され始めている。

 

追記

まずこれを読む。大変勉強になる。

http://lab.loman.net/2018/05/25/dna-extraction-book-chapter/#__RefHeading___Toc505877554

 

追記 Protocols.ioにDNA抽出プロトコルが上がっています。

1、

High purity, high molecular weight DNA extraction from rust spores via CTAB based DNA precipitation for long read sequencing protocol by Ramawatar Nagar

2、

High molecular weight gDNA extraction after Mayjonade et al. optimised for eucalyptus for nanopore sequencing protocol by Miriam Schalamun

3、

https://www.protocols.io/view/high-quality-dna-from-fungi-for-long-read-sequenci-k6qczdw

4、

Nuclear DNA purification from recalcitrant plant species for long-read sequencing protocol by Ashley Jones

 

5、ONT HPのExtraction methods(log inしておく必要あり。プロトコルのPDFをダウンロードできる)

https://community.nanoporetech.com/extraction_methods

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 6、High Molecular Weight DNA Extraction from Recalcitrant Plant Species for Third Generation Sequencing 

7、Ultra-long Read Sequencing for Whole Genomic DNA Analysis

 8、2019 9/29

High molecular weight DNA isolation method from diverse plant species for use with Oxford Nanopore sequencing

 

2020 2/28 ビデオジャーナルの論文のリンクをいくつか張っておきます。


 

 

 

 

DNAの純度

Minionのシーケンスにはハイクオリティなlong DNAが必要である。

Oxford Nanopore社のHPに記載されているCriteriaを載せておく。

  • Purity as measured using Nanodrop - OD 260/280 of 1.8 and OD 260/230 of 2.0-2.2
  • Average fragment size, as measured by pulse-field, or low percentage agarose gel analysis >30 kb
  • Input mass, as measured by Qubit - 10 pg
  • No detergents or surfactants in the buffer

DNAの定量は、low bind tubeに溶かし、Qubitなどの蛍光法により行う。Nanodropなどを使った260nmの測定はRNA、NTP、ごく微量のフェノールなど様々な夾雑物に影響を受けるため、はっきり言って全くあてにならない。夾雑物が疑われるなどの理由でDNA抽出後に追加精製を行うなら、Pacbioのガイドで勧められているフナコシのPowerClean DNA Clean-Up Kitなどが良いかもしれない。土壌サンプル向けのカラムキットで多糖類や腐食酸も除けるようである。

追記 上にリンクを貼ったprepirntでは、260/230が"1程度"の低いサンプルは、シーケンススループット1桁くらい落ちている(Preprint 表1)。

 2019 6/19 追加

London Calling 2019: Stella Loke

Optimising Plant DNA extraction for nanopoe sequencing


 

 

DNAの長さ

長い切れていないDNAを抽出できれば、それだけ長いDNAを読む率が長くなる。カビのゲノム解析のペーパー(リンク)では、ゲノム抽出後にBlue Pippinでサイズセレクションすることで、平均サイズが大きく向上したと報告されている。また、このサイズセレクションを行うタイミングは、ゲノムをとった後でなくライブラリ調整後がベストらしい(Omics! Omics!: Nanopore Workshop Notes)。Blue Pippinは国内では日本ジェネティクス社から買えるようである(リンク)。大崎さんのBlue Pippin解説(リンク)。

高分子のDNAを回収するには、DNAの調整時の取り扱いも細心の注意を払う必要がある。ナノポアHPには以下のように記載されている。

  • Using wide-bore pipette tips to handle the gDNA
  • Mixing gently but thoroughly by inversion, as opposed to vortexing or pipetting
  • Avoiding unnecessary freeze-thaw cycles
  • Avoiding pH <6 and >9
  • Avoiding high temperatures, which can lead to degradation

特に抽出後の確認の電気泳動でゲノムがスメアになっているようなサンプルは使うべきではない。

追記

カラムを使わず低コストに高分子量genomic DNAを抽出する方法

Extraction of high-molecular-weight genomic DNA for long-read sequencing of single molecules

https://www.future-science.com/doi/full/10.2144/000114460#

 

キットのプロトコル

https://community.nanoporetech.com/protocols 

f:id:kazumaxneo:20190111104147j:plain

 

2019 1/11 追記

追加精製

どのような技術でDNA抽出したとしても、ラン前にSPRI技術で追加精製して2kb以上のDNA断片をエンリッチすることで、より効率的なシーケンシングが可能になります。詳細は、上にリンクを載せたExtraction methodsの、SPRI size selection protocol for >1.5-2 kb DNA fragmentsを確認して下さい。以下のHPも参考になります。 

https://albertsenlab.org/all-i-want-for-christmas-is-a-terabase-of-nanopore-data/

 

2019 9/13 

publishから時間が経ってますが、以下の論文にはシーケンシングを成功させるノウハウが詰まっています。植物を使っている人以外も読んだ方がいいと思います。

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/1755-0998.12938

 

ラン

簡単に流れを載せておきますが、Oxfordナノポアのシーケンス技術はコミュニティベースで進化し続けています。ラン前にプロトコルがバージョンアップしていないか、MinKNOWのアップデートはないか確認しておいて下さい。

https://store.nanoporetech.com/media/wysiwyg/Rapid_Lambda_Control_Experiment_SQK-RAD004_.pdf

 

0、ソフトウエアのインストール

log inしてから右側のsoftware Downloadsを選択。

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端末で動くGuppyやAlbacoreもダウンロードできる。

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1、ライブラリ調整

1DのR9.4フローセルのRAD-003のプロトコルに従う。~400 ng DNAを7.5µlのボリュームで用意する必要がある。

追記: input DNA量についても、上のPrepirntが詳しく触れられている。DNA repair and end-prepは、0.2pmolのDNAに対して最適化されていると書かれており、これは平均8kbの2本鎖DNAだと1ugになる。平均24kbだと3ugになる(Sequencing library preparationtyより)。

 

2、フローセルの準備。

フローセルを冷蔵庫から取り出し、ダミーセルと交換する。

 

3、ソフトの立ち上げ 

MinionをつなぐPCから専用ソフトのMinKNOWを立ち上げる。MinKNOWは購入者のログインページから検索すれば見つかるので、前日までにインストールしておく。

MinKNOW立ち上げ時、ホストマシンはネットに接続して、さらにUSB3.0を介してMinionをつないでおく必要がある。

 

我々だけかもしれないが、MinionのUSB3.0 CタイプポートとPCをつなぐUSB3.0のケーブルが同封されていなかった(間違いでしたらすみません)。

修正 ↓入ってます。

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初めにQCを行う。

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3、サンプルの投入。

ランの手順はナノポア公式ページに動画で説明されている(購入者アカウントでログインして、以前は右上の検索ウィンドウから"Priming the SpotON Flow Cell Print step"で検索)説明動画(写真のキャプチャ)にリンクしていたが、2018年3月に確認したところ、HTMLマニュアルに切り替わっていた。

Minionのページからマニュアルのリンクに飛ぶことができる(Log inしている必要あり)。そこではランニング手順が記載されている。

3-1~

f:id:kazumaxneo:20180313144403j:plain

f:id:kazumaxneo:20180313144420j:plain

5-1

f:id:kazumaxneo:20180313144509j:plain

f:id:kazumaxneo:20180316133628j:plain

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f:id:kazumaxneo:20180316133650j:plainこの後もHTML manualは続いている。公式ではlambdaを使っているが、サンプルも同様の手順でランできる。

 You tubeに動画があったのでそれを載せておく。

 

ポートは弁の役割も果たしているので、動画の順番通りに進める必要がある。我々はををランを一回止めてサンプルを途中で追加投入する際に、priming portを開けてなかったためサンプルがうまくロードできなかった(吸い戻してなんとかリカバーした)。

 Live base callを選択すると、リアルタイムで徐々にfast5からfastqに変換してくれる。ただしこれには時間がかかる様である。

 

ラン前。

f:id:kazumaxneo:20171006171649j:plain

 

poreの活性を表示する画面(数時間後)。

f:id:kazumaxneo:20171004233319j:plain

 

こちらはラン10分後のリード長分布。

f:id:kazumaxneo:20171006171828j:plain

時間とともに、長いリードも増えてくる。 

 

36時間ラン後。まだいくつか緑のセルがある。

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48hランすると数万リード得られる。ただしサイズ分布によってリード数は当然変わってくるので、ライブラリによってリード数は大きく変わってくる。(ロングを1-2万読んだデータと、100bp以下のジャンク(10-20%エラーを含むショートリード)をたくさん含む10万リード(5倍)、どっちがアセンブルに有利だろうか)。

 

 

 

ポアの色は以下のように説明されている。

f:id:kazumaxneo:20171006163619j:plain

f:id:kazumaxneo:20171006163607j:plain

f:id:kazumaxneo:20171006163627j:plain

f:id:kazumaxneo:20171006163631j:plain

f:id:kazumaxneo:20171006163638j:plain

f:id:kazumaxneo:20171006163644j:plain

f:id:kazumaxneo:20171006163654j:plain

f:id:kazumaxneo:20171006163702j:plain

f:id:kazumaxneo:20171006163709j:plain

f:id:kazumaxneo:20171006163713j:plain

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  •  ラン中のポアは、まずAdapterの黄色になり、それからしばらくすると緑のポアに変わっていく(時折だが一瞬色が変わることもある)。リードが取り込まれてアダプターから徐々にDNAが読まれているからと考えられる。
  • 黒色は完全にダメになったポアである。また、オレンジも1つの区画に複数ポアがあるもので、信号が混在してしまい利用できないセルとなる。
  • 青いセルも出てないセルである。ただし、途中でサンプルを追加投入すると青の区画も緑に戻るものがいくつかあった。完全にダメなセルではないらしい(未確認)。
  • データは指定したディレクトリにどんどん追加されていく。他の方の情報によると、4000リードくらい読むと次のフォルダに切り替わるらしい。48hランすると、いくつかのフォルダができることになる。

公式HPの説明を貼っておく。

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追記

Miriam Schalamunさん達のPreprinrtで、"ratio of ‘in strand’ (light green) to the sum of ‘in strand’ plus ‘single pores"を最初の数時間評価し、占有率が悪い時はwashすることを述べている(図8より)。

 

コマンドラインで動く basecallerもいくつか発表されています。albacoreとguppyはoxford nanoporeのオフィシャルbasecallerです。

 

スループット

ポアの活性やサンプル品質に大きく左右されるので一概には言えないが、読み取り速度は450bpsに調整されているらしい。ここでは2G出力されたと報告されている。また、ヒトゲノムをアセンブルしたという報告では39台のMinionを使い、トータル14,183,584 リード得て、トータル長は91,240,120,433 baseだったと述べられている(30x)。ということは、1台あたり平均363681リードで2.3Gb (23億)読んだことになる。データの大半はLigation kitで構築されたライブラリ由来らしい。本当なら素晴らしいスループットである。また、Nanopore R9 rapid run data release · Loman Labsでも1Dで2G、2Dで0.6G読めたと報告している。

ただし、http://seqanswers.com/forums/showthread.php?t=71774では0.5Gに達しなかったという話もある。SRAに登録されているデータを見ると、さらにばらつきが多い。この登録データでは7台のMinionを使っているようだが、スループットに大きな開きがある(バーコードシーケンスと書かれていないが、もしかしてバーコードシーケンス?)。

また日本でシーケンンスする場合、イギリスで作られて発送されるため、shippingで2週間くらいはどうしてもかかってしまう。その影響はどれくらいあるのだろうか?(早く届くこともあります。前回頼んだ時は1/24に注文して1/28にshipping、30に届きました)。

 

上記のリンクのLoman labでは、E.coliを1Dと2Dで読んだデータを公開してくれています。興味がある人はアクセスしてみてください。中盤のリンクから1Dと2Dのfast5データと、変換済みfastaがダウンロードできます (fast5は200~300GBくらいあります)。

Nanopore R9 rapid run data release · Loman Labs

 

追記

1、2018年3月に知り合いが行ったシーケンスでは、3.2Gbと6.1Gb読めていました(raw fastq)。

 2、https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5803254/

この論文ではONT Ligation Sequencing Kitで調整したシロイヌナズナゲノムをMinionでシーケンスして3.4Gbの base callを得ています。200kb以上のリードも4本得られたと書かれています。miniasmなどでアセンブルするのが構造変化を検出するためにシンプルで最短の方法だと結論付けています。

3、上にもリンクを貼ったPreprint(リンク)では 、R9.5で安定して6-8Gb読めています。

4、複数のbacteria菌株のシーケンスとアセンブリパフォーマンス比較。MiseqとMinionのハイブリッドアセンブリを行なっている。bacteriaのロングリードシーケンシングでどのくらい読めばいいか参考になる。

https://www.biorxiv.org/content/biorxiv/early/2018/07/05/362673.full.pdf

 

 

 

 

まとめ 

ナノポアのシーケンスに求められるのは"長さ"である。リード数が少なめでも、リピートをカバーできるだけのロングリードが読めていれば、その分だけアセンブルにとって有利になるし、ライブラリ中に1000bp以下の分子のコピー数が多く残っていれば、どれだけリードがたくさん読めていても、アセンブルのcontiguityの改善には限界がある。いかに切れていない綺麗なDNAを抽出してランできるかが結果を左右する。

 

 参考資料

Sample preparation and DNA extraction in the field for nanopore sequencing · Loman Labs

 

http://seqanswers.com/forums/showthread.php?t=21280

 

http://seqanswers.com/forums/showthread.php?t=76021

 

2016年nanopore ワークショップに参加した研究者の方の記事

Omics! Omics!: Nanopore Workshop Notes

 

SSDの容量について(ログインが必要)

https://community.nanoporetech.com/posts/is-260gb-of-disk-space-eno

 

R9スループット

http://lab.loman.net/2016/07/30/nanopore-r9-data-release/

 

 

追記 2018 09/25

Oxford Nanopore Technologiesの宮本さんが、ブログにアセンブリとSV検出の流れをアップされています。


ナノポアシーケンサーMinIONインプレッション

ナノポアシーケンサーMinIONインプレッション | 酵母とシステムバイオロジー

 

追記 2018 10/06

MinIONとGridIONのフローセルが新しくなったようです。読み込み速度が強化され、耐久性も72hに伸び、アナウンスによると30Gbのyieldが期待できるようです。

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Oxford Nanopore releases ‘Rev D’ flow cells, enabling increase in data yields 

 

追記 2018 10/23

Nanoporeには様々なbasecallerがありますが、Ryan Wickさんがbasecallerを変えた時の違いを調べてまとめられています。

base call時点で大きな違いが出ていますが、nanopolishでmethylation-aware オプション付きでpolishingする限り、polish後の配列のエラー率に差はほぼなくなるようです。

 

*1

Nanopore公式ページで、枯草菌から複数のキットでDNA抽出してシーケンシングした時のフラグメントサイズ結果が掲載されている。使っているのは、QIAGEN Genomic-tip 500/G、QIAGEN MagAttract HMW DNA Kit、Circulomics Nanobind DNA Kit、QIAGEN Puregene Yeast/Bacteria Kit bになる。シンプルなワークフローで高分子DNAが十分に回収できるMagAttractか、とにかくより高分子DNAが取れるPuregene Yeast/Bacteria Kit(ただし収量が少ない)の使用が推奨されている。また、いずれの方法でも、シーケンシング前にSPRI技術を使ったサイズセレクトを行うことが推奨されている(参考)。(生物によっては、この方法だけで高分子gDNAが取れるとは限らないことに注意してください。細胞壁の破砕、エンドヌクレアーゼの不活性化、不純物によるカラム目詰まり、など想定しておくことはたくさんあり得ます)。

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Nanopore公式ページより転載。やりすぎると非常に短いプラスミドも消える可能性があります。実験の目的に合わせて考えて下さい。

 

ロングリード関連のツール

 

2019 3/2追記

面白いものが出てますね。原理は不明ですが低分子DNAを除去できるようです。

https://community.nanoporetech.com/posts/circulomics-short-read-eli

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追記

この試薬に限らず当たり前の話ですが、処理することでかなりモル数は減ります。処理後ナノポアでランできるできるだけのDNAを想定して使わないと量が減って失敗します。ご注意ください。

2020 1/26 (植物)うまく使えば、かなりの高分子DNAを精製できるようです。

 

 

 

2019 3/10追記

日本ゲノム微生物学会 ニュースレターMinION Q&A(16ページ)

https://www.sgmj.org/pdf/newsletter/sgmj_no17.pdf

 

Stack Exchange  --Bioinformatics--

Questions tagged [nanopore]

https://bioinformatics.stackexchange.com/questions/tagged/nanopore

 

2019 3/15追記

ついに出てきましたね。

 

2019 3/18

Flongleが買えるようになりましたね、MinIONかGridIONのデバイスに取り付けて、MinIONより小スケール(126チャネルでMinION の512ポア相当)でランできます。値段は日本円でおよそ60万くらいで、48フローセル付いていて、1年間で小分け出荷できるようです(要確認)。1本あたり110米ドルくらいの計算で、16S/18Sアンプリコンやスモルーゲノムシーケンシングに適してそうですね。そのうちイールドの報告も出て来ると思いますのでtwitterチェックしておきましょう。

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2019 3/22 

 

2019 6/6

マーケティング上の理由なのかイールドが足りないのが理由はよくわかりませんが、Flongleが12パックでも購入できるようになってますね。

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 その後、1−2個から購入可能になっています。

 

知人がフロングルについて問い合わせた時の回答  

Flongleのフローセルと、MinIONで使用するフローセルとの違い

フロングルは

・126チャネル(MinIONは512)

・フロングルランタイム:約16-24時間

・フロングルフローセルの前にCTCとアダプターが送付される

・フロングルフローセルは一回使用のみで返却の必要なし

・MinION/GridIONのみに使用可能

・9.4.1ポア(1D2キットとは使用不可)

・使用期限:4週間

・保存温度:通常のフローセルと同様

・推奨温度と使用期限を守り、使用前のQCポア数60以下だった場合交換対応

・ Flow cellで1.8Gb記録(22時間ラン)

・アダプターはのちにストアにて販売予定だが、現在必要な場合はフロングルのスターターパックを再度購入する。

 

7/5 Protocol.ioにmicroalga向けのDNA抽出プロトコルが上がってます。


2019 8/21 

Nanopore Day, Tokyo に関するツイート

 

Nanopore Day, Tokyoに行った人から聞いた話を2点追記。話半分で聞いてください。

  • DNAが減ってきてDNAがない状態で電荷がかかり続けると、ポアが早く傷んでしまう。よって減ってきたら素早くウオッシュし、DNAを追加する。これを繰り返すことでシーケンスイールドを上げることができる(=48h放置は良くない)。
  • 良くなっているが、R10は結構厳しい。dual channel?で読んでいるが、まだ発展途上。(当たり前だが)TGSの問題であるホモポリマーシーケンスエラーは解決していない。

 

#GenomeScience2019 - Twitter Search

 

Rocky Mountain adventures in Genomic DNA sample preparation, ligation protocol optimisation / simplification and Ultra long read generation

Rocky Mountain adventures in Genomic DNA | Long read club

 

 

R10のパフォーマンス

http://albertsenlab.org/ar10e-we-there-yet/

 

 Fire Monkey HMW DNA extraction

https://revolugen.co.uk/revolugens-dna-extraction-technologies/

良さそうですね。 

 

有償のワークショップもあります。

https://store.nanoporetech.com/catalog/product/view/id/272/category/25?utm_campaign=Japan&utm_source=hs_email&utm_medium=email&utm_content=78612458&_hsenc=p2ANqtz-9dROSHJK9PwRT-bJXwW-NMnGJEZIZqRM1PBhRsxgrdC9InGRun92TAYLC93C4bkATBrEgavzrPY2OtcoKgSBcoPTu25aXBMyZJ-Tv6BmIREd0JG98&_hsmi=78636051

 

2019 12/6追記

 

2020 1/14 

R10.3

 

2/22

 

3/15

"We provide a high-resolution map of SARS-CoV-2 transcriptome and 22 epitranscriptome using nanopore direct RNA sequencing and DNA 23 nanoball sequencing."

 

 4/5

 

5/9


6/19

 

7/26

Brassica napusゲノムアセンブルの査読前論文。"6X with reads longer than 100Kb"などのウルトラロングシークエンシングをしている。テクニック全般において非常に勉強になる。真核生物のゲノムアセンブリに取り込んでいる人は必読。

https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.07.22.215749v1

(2020年12月にpublish;  https://academic.oup.com/gigascience/article/9/12/giaa137/6034787

 

Potato

https://academic.oup.com/gigascience/article/9/9/giaa100/5910251

 

10/21

精度がほぼQ20に達する。

 

11/25

 

12/7

 

12/21

 

12/26

 

2021

1/21

 

 

2/2

精度がQ20を超える

 

植物の組織サンプルから開始し、7日以内に高品質のドラフトゲノムを作成するための完全なデノボ植物ゲノム作成ワークフローの設計 (ONT & Pacbio)。

 

ロングリードライブラリ調製に使用される試薬のゆっくりとしたピペッティングを自動化する3Dプリント可能な装置。手動のスローピペッティングに比べてライブラリーの平均リード長を増加させた。

 

MinIONを使用したSARS-CoV-2ゲノムのRNA抽出からハイスループットシークエンシング、及びオンライン可視化ツールを使用した解析までの包括的な作業プロトコル

 

2/23 

小さなプラスミド配列を回収する能力を評価する目的で、ライゲーションライブラリとラピッドライブラリのアプローチを比較している。

Recovery of small plasmid sequences via Oxford Nanopore sequencing | bioRxiv

 

3/1

 3/3

3/4

ロングリードメタゲノミクスのための高分子量DNA抽出法を比較した。メタゲノミクスの観点からは、非常に長いシーケンスよりも中程度の長さのシーケンス(10〜50kbp)がたくさんある方が興味深い。それはアセンブリメトリクスを改善し、より多くのシングルコピーコア遺伝子とrRNA遺伝子で分類学的プロファイルにも影響を与える。

2022 1/25 Mol Ecol Resour. 2022 Jan 23. doi: 10.1111/1755-0998.13588 (pubmed)

 

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Oxford Nanopore Events アカウントをフォローしておくと、今回のオックスフォードナノポアカンファレンスの要点を知ることができます。

いくつかツイートを貼っておきます。

 

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ヒトGRCh38やシロイヌナズナTAIR10参照ゲノムのように、最も精査されたゲノムでさえ、生物学的に重要なセントロメアやその他の大きな繰り返し領域を表現できていない。このプレプリントでは、ウルトラロングリードシーケンシングを用いて、5つのセントロメアをすべて解明したCol-CENシロイヌナズナゲノムアセンブリを構築した。

 

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純粋な高分子量DNAの抽出には限界があり、植物や菌類では特に困難である。この問題を解決するために、本研究では、ロングリードシーケンシングのための高分子量DNAの抽出、クリーンアップ、サイズ選択のプロトコルを紹介する。紹介するプロトコルを用いて、オックスフォード・ナノポア社のMinIONでシーケンスを行うと、リード長N50値が30-50kb、リード長が200kbを超え、出力が15-30Gbpになる。これは、様々な植物、真菌、動物、バクテリアのサンプルでルーティンに達成された。

 

 

ONTによるゲノム配列の決定とアセンブルには、ロバストな実験デザインが必要だが、真核生物を対象とした研究はほとんどない。いくつかのモデル生物のシーケンスおよびアセンブリのベストプラクティスを特定するために、シミュレーションおよび経験的なONTとDNAライブラリを使用した新しい結果を紹介する。


9/8

バナナゲノムのT2Tアセンブリ(バージョン4アセンブリ)の報告。ONTのリードも使用されていて、いくつかのアセンブラを検討した結果、NECATが一次アセンブリに使用されています(Supplementary Table.8に比較結果)。結果を見ると、リピートはかなり存在していますが、DH Pahangというホモ接合2倍体が使用されていて、これがアセンブリが奏功しているポイントの1つになっているのでしょうか。


9/21

 

10/8 (9/23のツイート)

 

10/19

低入力量での抽出およびライブラリ調製アプローチを評価する実験を考案した。従来のスピンカラムを用いたDNA抽出ではなく、磁気ビーズを用いた最適なビーズビート法を用いることで、分子の長さ、インテグリティスコア、DNA収量のいずれも向上することが分かった。考案した迅速な抽出プロトコルと低入力量のライブラリ構築により、単一の昆虫(Drosophila melanogaster)から、125Mbp / 参照ゲノムの85 %、BUSCO遺伝子の96.9%以上を網羅し、コンティグN50が1.2Mbp以上で、染色体アームサイズのコンティグを含むデノボアセンブリを、600GBP以下の安価な消耗品コストで生成することができた。

 

Adaptive sampling

 

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12/4

注;duplexリードは、は1分子DNAのtemplate鎖とcomplement鎖を連続してシークエンシングして得られる新方式のリード。上のツイートの通り、条件が揃えば非常に高い精度の配列決定結果を得られるらしい。2021年5月の発表

 

12/31

ナノポアセンサーアレイ技術(Oxford Nanopore Technologies社のMinIONデバイス)を用いて、バーコード付きの出力鎖を高並列に直接検出することにより、DSD回路の活性をリアルタイムで動態測定できる多重化シーケンスフリー読み出し方法を提案する。ディープラーニングを用いて、生のナノポア信号から直接、人工レポータープローブを1分子レベルで高精度に検出・分類できることを示す。次に、臨床的に関連するマイクロRNA配列の多重検出において、この方法の有用性を実証する。これらの結果は、DSDの出力帯域幅を蛍光分光法よりも1桁増加させ、DNA回路の読み出しや携帯型ナノポア装置を用いたプログラム可能な多重分子診断における新しいパラダイムの基礎を築くものである。

 

2022

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”存在量はべき乗則に従うことが多く[7]、このことは、メタゲノムサンプルの配列決定によって、ある種の生物種を深くカバーし、他の種のカバー率が低いか部分的になるデータが得られることを意味することがある。希少な種のシークエンスの出力を最大化する効果的なエンリッチメント戦略は、この弱点と生物多様性の盲点に対処するものである。オックスフォード・ナノポア・テクノロジーズ(ONT)のAdaptive Sampling Concept(選択的シーケンスと呼ばれることもある)は、ソフトウェア制御によるエンリッチメントの一形態と言える。分子の最初の数百塩基を調べ、その分子が「ターゲットの分子」であるかどうかを判断し、ターゲットから外れた分子は、孔に流れる電流を逆流させて排出し、孔を解放して新しい分子を捕らえる。

我々は、DNA分子の長さがAdaptive Samplingの効率と効果に及ぼす影響を調査し、MAGと診断の両方のアプリケーションにおける有用性を判断したいと考えた。ここでは、既知の相対的存在量とリード長分布が与えられたメタゲノム・コミュニティで可能なエンリッチメントレベルを予測する数学的モデルを提示する。”

 

1/28

"当研究室では、ゲノム配列決定パイプラインの自動化を図るため、ロボット生物学研究所の両腕型人間型ロボット「Maholo LabDroid」に、細胞溶解液からの有機溶媒によるゲノムDNA抽出を行うようプログラミングを行った。フェノール・クロロホルム抽出の自動化については、我々の知る限り、今回が初めての報告である。"

(DOI: doi: https://doi.org/10.1101/2022.01.26.477939のフル動画リンク

(* リンクされているプレプリントの著者ではない)

 

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”これは、基本的にベースコールモデル(fast, hac, sup)と chunks_per_runner の値のリストを取り、それらを繰り返し実行する非常に初期のドラフトコードです。Guppy実行の詳細(ベースコール率、サンプル/秒を含む)を記録し、またGPU使用統計も記録してます。時間が許す限り、より多くの機能を追加したいのですが、これは現在の形で一部の人に役立つかもしれないと思いました。”

 

3/15

 

"第3世代のロングリードシーケンスが植物ゲノム科学に変革をもたらす。Oxford Nanopore TechnologiesとPacific Biosciencesは競合するロングリードシーケンス技術を提供し、植物科学者が大規模で複雑な植物ゲノムでさえ調査できるようにする。シーケンシングプロジェクトは1つの研究グループで実施することができ、小規模な植物ゲノムのシーケンシングは数日で完了できる。また、陸上植物の起源と進化に関連する基本的な疑問を解決するために、複数の種のゲノムを大規模に調査することが多くなった。配列決定装置や使いやすいソフトウェアが入手しやすくなったことで、より多くの研究者がゲノム解析に携わることができるようになった。現在の課題は、2倍体や多倍体のゲノム配列を正確に解析することと、単一の参照ゲノム配列からパンゲノムグラフに切り替えることで種内多様性をよりよく反映させることである。”

論文中ではDNA抽出方法についても引用して議論しています。植物の高分子DNA抽出は難易度が高いので、携わっている方は読まれた方が良いかと思います。

 

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4/26

"Long-read nanopore sequencing provides significant clinical utility when assessing the parental origin of de novo variants."

 

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5/11

 

5/14

"75種の多様なイネ属を選択し(Supplemental Table S1)、Oxford Nanopore Technologiesロングリード(平均デプス68.71×)(Supplemental Table S2)およびIlluminaショートリード(平均デプス69.04×)(Supplemental Table S3)プラットフォームを用いてシークエンシングし、de novoアセンブルした。このコンティグを修正して染色体レベルのスキャフォールドにアセンブルしたところ、平均N50は33.08Mb、平均BUSCO(Benchmarking Universal Single-Copy Orthologs)スコアは98.25%に達した。また、他のバッチから得られた13ゲノム(Supplemental Table S4)、および公開データベースから得られた25ゲノム(Supplemental Table S5)も本研究に含まれる”

 

5/21

 

 

 

 

6/24

”市販のプラスミドシーケンスオプションの代替として、オックスフォード・ナノポア・テクノロジーズのMinIONデバイスを使用した費用対効果の高い正確なプラスミドシーケンスおよびコンセンサス生成手順について説明する。"


 

7/6 (2021年のプレプリントの査読された論文)

”Oxford Nanopore R10.4を使用することで、ショートリードやリファレンスベースの研磨を行わずに、単離株やメタゲノムからほぼ完成された微生物ゲノムを生成できることを示す。(中略)7種の細菌と1種の真菌からなるZymo mock のシーケンスを通して、Oxford Nanopore R9.4.1 および R10.4 データからほぼ完成した微生物ゲノムを得ることができるかどうかを評価した。R9.4.1のデータとは対照的に、R10.4ではIllumina polishingの追加によるアセンブリ品質の大きな向上は見られなかった(図1c、補足図1)(補足;ONTだけで十分に高品質ということ)。R9.4.1からR10.4へのアセンブリ精度の向上は、ホモポリマーのコール能力の向上によるところが大きい(図1b、補足図2、図3)。(中略)R10.4データでは長さ<11 bpまでのホモポリマーの大部分が正しく分解されていた(補足図4)。”


 

珪藻Phaeodactylum tricornutumのT2TアセンブリGCAリンク)。Oxford Nanopore MinIONフローセルR9.4.1とイルミナが使用されている。テロメア配列を組み立てるための戦略などとても勉強になります。

ENAにFAST5のtar.gz (およそ102GB)も登録されていますね(リンク)。

 

 

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"ナノポアリードは、ショートリードアセンブラによってどの程度アセンブルできるのでしょうか? 1/8"

 

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