RNA-SeQC 2

　サンプルの品質は、サンプルの保管、抽出、シーケンスプロトコルによって影響を受けるため、シーケンス後の品質管理は、RNAシーケンス（RNA-seq）データの生成と解析に不可欠な要素である。RNA-seqは、数百から数万サンプルの規模のコホートに適用されることが多くなっているが、既存のツールはこのような規模に容易に対応できず、また、幅広いサンプルタイプと品質に対応できるように設計されていない。ここでは、RNA-SeQC（DeLuca et al., 2012）を効率的に再実装したRNA-SeQC 2について説明する。このツールは、幅広いRNA-seqプロトコルにおいてサンプルの品質を特徴づけるように設計された複数のメトリクスを追加している。
　コマンドラインツール，ドキュメント，C++ソースコードは，GitHubリポジトリ（https://github.com/getzlab/rnaseqc）で公開している。本論文の図を再現するためのコードとデータは、https://github.com/getzlab/rnaseqc2-paperで利用できる。

インストール

ubuntu18.04のminiconda3.8環境でcondaの仮想環境を作って導入した（mamba使用）。

Github

#bioconda (link)
mamba create -n rna-seqc -y
conda activate rna-seqc
mamba install -c bioconda rna-seqc -y

#docker (link)
docker pull gcr.io/broad-cga-aarong-gtex/rnaseqc:latest

> rnaseqc

$ rnaseqc -h

  rnaseqc [gtf] [bam] [output] {OPTIONS}

    RNASeQC 2.3.5

  OPTIONS:

      -h, --help                        Display this message and quit

      --version                         Display the version and quit

      gtf                               The input GTF file containing features

                                        to check the bam against

      bam                               The input SAM/BAM file containing reads

                                        to process

      output                            Output directory

      -s[sample], --sample=[sample]     The name of the current sample. Default:

                                        The bam's filename

      --bed=[BEDFILE]                   Optional input BED file containing

                                        non-overlapping exons used for fragment

                                        size calculations

      --fasta=[fasta]                   Optional input FASTA/FASTQ file

                                        containing the reference sequence used

                                        for parsing CRAM files

      --chimeric-distance=[DISTANCE]    Set the maximum accepted distance

                                        between read mates. Mates beyond this

                                        distance will be counted as chimeric

                                        pairs. Default: 2000000 [bp]

      --fragment-samples=[SAMPLES]      Set the number of samples to take when

                                        computing fragment sizes. Requires the

                                        --bed argument. Default: 1000000

      -q[QUALITY],

      --mapping-quality=[QUALITY]       Set the lower bound on read quality for

                                        exon coverage counting. Reads below this

                                        number are excluded from coverage

                                        metrics. Default: 255

      --base-mismatch=[MISMATCHES]      Set the maximum number of allowed

                                        mismatches between a read and the

                                        reference sequence. Reads with more than

                                        this number of mismatches are excluded

                                        from coverage metrics. Default: 6

      --offset=[OFFSET]                 Set the offset into the gene for the 3'

                                        and 5' windows in bias calculation. A

                                        positive value shifts the 3' and 5'

                                        windows towards eachother, while a

                                        negative value shifts them apart.

                                        Default: 150 [bp]

      --window-size=[SIZE]              Set the size of the 3' and 5' windows in

                                        bias calculation. Default: 100 [bp]

      --gene-length=[LENGTH]            Set the minimum size of a gene for bias

                                        calculation. Genes below this size are

                                        ignored in the calculation. Default: 600

                                        [bp]

      --legacy                          Use legacy counting rules. Gene and exon

                                        counts match output of RNA-SeQC 1.1.9

      --stranded=[stranded]             Use strand-specific metrics. Only

                                        features on the same strand of a read

                                        will be considered. Allowed values are

                                        'RF', 'rf', 'FR', and 'fr'

      -v, --verbose                     Give some feedback about what's going

                                        on. Supply this argument twice for

                                        progress updates while parsing the bam

      -t[TAG...], --tag=[TAG...]        Filter out reads with the specified tag.

      --chimeric-tag=[TAG]              Reads maked with the specified tag will

                                        be labeled as Chimeric. Defaults to 'mC'

                                        for STAR

      --exclude-chimeric                Exclude chimeric reads from the read

                                        counts

      -u, --unpaired                    Allow unpaired reads to be quantified.

                                        Required for single-end libraries

      --rpkm                            Output gene RPKM values instead of TPMs

      --coverage                        If this flag is provided, coverage

                                        statistics for each transcript will be

                                        written to a table. Otherwise, only

                                        summary coverage statistics are

                                        generated and added to the metrics table

      --coverage-mask=[SIZE]            Sets how many bases at both ends of a

                                        transcript are masked out when computing

                                        per-base exon coverage. Default: 500bp

      -d[threshold],

      --detection-threshold=[threshold] Number of counts on a gene to consider

                                        the gene 'detected'. Additionally, genes

                                        below this limit are excluded from 3'

                                        bias computation. Default: 5 reads

      "--" can be used to terminate flag options and force all following

      arguments to be treated as positional options

テストラン

GTFファイル、BAMファイル、BEDファイルを指定する。

git clone https://github.com/getzlab/rnaseqc.git
cd rnaseqc/
rnaseqc test_data/downsampled.gtf test_data/downsampled.bam --bed test_data/downsampled.bed --coverage .

GTFをパースする際にエラーが起きる（*1）。改善されましたら追記します。

引用

RNA-SeQC 2: efficient RNA-seq quality control and quantification for large cohorts
Aaron Graubert, François Aguet, Arvind Ravi, Kristin G Ardlie, Gad Getz
Bioinformatics, Published: 02 March 2021

参考

https://github.com/getzlab/rnaseqc/issues/34

参考

https://github.com/getzlab/rnaseqc/issues/34

関連