ハプロタイプ間の遺伝的差異を解明するためには、Diploid assembly（二倍体アセンブリ）、すなわち相同染色体の配列を別々に決定することが不可欠である。一つのアプローチは、リファレンス配列上で一塩基変異（SNV）をコールし、phase化することである。しかし、この方法は、大きなセグメント重複（SD）や構造変異（SV）では、これらの領域から得られたリードのアラインメントが信頼できない傾向があるため、不安定になる。もう一つのアプローチは、高精度のPacBio HiFiリードを使用して、二倍体アセンブリを直接出力することである。しかし、HiFiリードは、その長さよりも長いホモ接合領域のphaseを決定（位相決定）することができず、完全なphasingされたアセンブリを作成するには、oxford nanopore technology（ONT）リードまたはHi-Cが必要で。ある。正確な2倍体アセンブリを作成するには、単一のロングリードシーケンス技術で十分なのだろうか？
ここでは、メガベーススケールの2倍体ゲノムアセンブラであるJTKを紹介する。JTKは、まずロングリードからキロベーススケールの配列（チャンクと呼ばれる）をランダムにサンプリングし、そこで見つかったバリアントを相補し、2つのハプロタイプを生成する。JTKの斬新なアイデアは、チャンクを利用してSNVとSVを同時に捕捉することである。HG002と日本人サンプルの60倍ONTリードから、組織適合性複合体（MHC）領域と白血球受容体複合体（LRC）領域において、リファレンスベースのアプローチでは不可能であった2つのハプロタイプを約99.9%の精度で完全にアセンブルした。さらに、日本人サンプルのLRC領域では、JTKはハイカバレッジHiFi+Hi-Cから構築されたアセンブリよりも優れた連続性を出力した。これからのパンゲノミクスの時代において、JTKはリファレンスに基づいた相補的な手法で、アセンブルは難しいが医学的に重要な領域をアセンブルすることができるだろう。JTKはhttps://github.com/ban-m/jtk、データセットはhttps://doi.org/10.5281/zenodo.7790310、またはDDBJのJGAS000580で入手できる。
レポジトリより
JTKは、ヒトゲノムのHLA領域やLILR+KIR領域のような、医学的に重要でアセンブル困難な領域のハプロタイプresolvedな配列再構成を目的としたターゲット型2倍体ゲノムアセンブラである。JTKは、通常、ノイズの多いONTウルトラロングリード（およびオプションで他のタイプのロングリードデータセット）から、指定されたゲノム領域の2つの（ほぼ）完全なハプロタイプ配列のペアをde novoで正確にアセンブルする。
インストール
依存
- minimap2 with version >= 2.23.
- Rust with version >= 1.72.0 nightly.
git clone https://github.com/ban-m/jtk.git
cd jtk
cargo build --release
$ ./target/release/jtk --help
jtk 0.1
Bansho Masutani <ban-m@g.ecc.u-tokyo.ac.jp>
JTK regional diploid assembler
USAGE:
jtk [SUBCOMMAND]
OPTIONS:
-h, --help Print help information
-V, --version Print version information
SUBCOMMANDS:
assemble Assemble reads.
correct_clustering Correct local clustering by EM algorithm.
correct_deletion Correct deletions of chunks inside the reads.
encode Encode reads by alignments (Internally invoke `minimap2` tools).
encode_densely Encoding homologoud diplotig in densely.
entry Entry point. It encodes a fasta file into JSON file.
estimate_multiplicity Determine multiplicities of chunks.
extract Extract all the information in the packed file into one tsv
help Print this message or the help of the given subcommand(s)
mask_repeats Mask Repeat(i.e., frequent k-mer)
partition_local Clustering reads. (Local)
pick_components Take top n largest components, discarding the rest and empty reads.
pipeline Run pipeline based on the given TOML file.
polish Polish contigs.
polish_encoding Remove nodes from reads.
purge_diverged Purge diverged clusters
select_chunks Pick subsequence from raw reads.
squish Squish erroneous clusters
stats Write stats to the specified file.
> jtk pipeline -h
jtk-pipeline 0.1
BanshoMasutani
Run pipeline based on the given TOML file.
USAGE:
jtk pipeline -p <profile>
OPTIONS:
-h, --help Print help information
-p <profile> TOML configuration file. See example.toml for an example.
-V, --version Print version information
テストラン
各ステップの個別ランに対応するサブコマンドがあるが、jtk pipelineコマンドですべてのプロセスを実行できる。
#fastq（平均長25200-bp）
wget https://mlab.cb.k.u-tokyo.ac.jp/~ban-m/jtk/COX_PGF.fastq.gz
gunzip COX_PGF.fastq.gz
#config
wget https://mlab.cb.k.u-tokyo.ac.jp/~ban-m/jtk/COX_PGF.toml
#jtkのラン
jtk pipeline -p COX_PGF.toml 2> test.log
COX_PGF.toml -TOMLフォーマットの設定ファイルの中身
ロングリードのfastqのパス（5行目）、リードタイプ（7行目）、出力ディレクトリ（13行目）、出力のprefix（15行目）など確認する。
出力
cox_pgf/
temp.gfaがGFA形式のアセンブルされたコンティグ。temp.samはリードとアセンブリ間のアラインメント、temp.coverage.tsvアセンブリのカバレージ。
実際のランでは、minimap2を使ってリファレンスのターゲット領域のリードを集めてランする。レポジトリの例。
THREADS=20
REFERENCE=chm13v2.0.fa #CHM13
READS=ONT.fq
REGION=chr1:10000000-15000000
minimap2 -x map-ont -t $THREADS --secondary=no -a $REFERENCE $READS | samtools sort -@ 4 -O BAM > aln.bam
samtools index -@ 4 aln.bam
samtools view -O BAM aln.bam $REGION｜ samtools fasta > reads.fasta
レポジトリより
- 入力データとして最も有望なのは、ONTの100kbp以上、カバレッジ60倍以上の超ロングリードである。単一の60x ONT ULリードのシーケンス技術からのデータセットが与えられた場合、JTKは両方のハプロタイプの（ほぼ）完全な再構成を達成する。しかし技術的には、JTKはどのようなロングリードのシーケンスデータでも入力として受け付ける。
- 例えば、2つのヒトサンプル（HG002と日本人サンプル）について、JTKは60x ONTリードから組織適合性複合体（MHC）領域と白血球受容体複合体（LRC）領域の2つの完全なハプロタイプのアセンブルに成功した。得られたコンティグの配列精度は約99.9%で、ハイカバレッジHiFi+Hi-Cデータセットからのアセンブリーよりも良好なコンティグを示した。
- 10Mbp以上の領域はテストされていない。指定しない。
引用
JTK: targeted diploid genome assembler
Bansho Masutani, Yoshihiko Suzuki, Yuta Suzuki, Shinichi Morishita
Bioinformatics, Volume 39, Issue 7, July 2023
