ロングリードシーケンス技術は、その登場以来大きく進歩した。そのリードの長さは転写産物全体に及ぶ可能性があり、トランスクリプトームを再構築するのに有利である。既存のロングリードトランスクリプトームアセンブリ手法は、主にリファレンスベースであり、リファレンスフリーのトランスクリプトームアセンブリにはほとんど焦点が当てられていない。本著者らは、ロングリードのトランスクリプトームシーケンスデータのためのリファレンスフリーのアセンブリ手法である「RNA-Bloom2」https://github.com/bcgsc/RNA-Bloomを紹介する。シミュレーションデータとスパイクインコントロールデータを用い、RNA-Bloom2のトランスクリプトームアセンブリ品質が、リファレンスベースの手法と比較して遜色ないことを示す。さらに、RNA-Bloom2が必要とするピークメモリは27.0～80.6%、ウォールクロック実行時間は3.6～10.8%と、競合するリファレンスフリーメソッドと同等であることも明らかにした。最後に、Picea sitchensis（シトカスプルース）のトランスクリプトームサンプルのアセンブルへのRNA-Bloom2の適用について紹介する。本手法はリファレンスに依存しないため、高品質のドラフトゲノムアセンブリが容易に入手できない大規模な比較トランスクリプトミクスのための基盤を構築するものである。
レポジトリより
RNA-Bloomは、高速でメモリ効率の良いde novo転写物配列アセンブラです。以下のようなシーケンスデータ用に設計されています。
- シングルエンド/ペアエンドのバルクRNA-seq（strand-specific/agnostic）
- ペアエンドシングルセルRNA-seq（strand-specific/agnostic）
- ロングリードRNA-seq（ONT cDNA/direct RNA, PacBio cDNA)
インストール
mambaで導入してテストした（os: ubuntu18）。
依存
mamba install -c bioconda rnabloom -y
> rnabloom
$ rnabloom
RNA-Bloom v2.0.1
Ka Ming Nip, Canada's Michael Smith Genome Sciences Centre, BC Cancer
Copyright 2018-present
usage: java -jar RNA-Bloom.jar [-l <FILE FILE ...>] [-r <FILE FILE ...>]
[-pool <FILE>] [-long <FILE FILE ...>] [-sef <FILE FILE ...>] [-ser
<FILE FILE ...>] [-ref <FILE FILE ...>] [-rcl] [-rcr] [-rc] [-ss]
[-n <STR>] [-prefix <STR>] [-u] [-t <INT>] [-o <DIR>] [-f] [-k
<INT>] [-stage <INT>] [-q <INT>] [-Q <INT>] [-c <INT>] [-hash
<INT>] [-sh <INT>] [-dh <INT>] [-ch <INT>] [-ph <INT>] [-nk <INT>]
[-ntcard] [-mem <DECIMAL>] [-sm <DECIMAL>] [-dm <DECIMAL>] [-cm
<DECIMAL>] [-pm <DECIMAL>] [-fpr <DECIMAL>] [-savebf] [-tiplength
<INT>] [-lookahead <INT>] [-sample <INT>] [-e <INT>] [-grad
<DECIMAL>] [-indel <INT>] [-p <DECIMAL>] [-length <INT>] [-norr]
[-mergepool] [-overlap <INT>] [-bound <INT>] [-extend] [-nofc]
[-sensitive] [-artifact] [-chimera] [-stratum
<01|e0|e1|e2|e3|e4|e5>] [-pair <INT>] [-a <INT>] [-mmopt <OPTIONS>]
[-lrop <DECIMAL>] [-lrrd <INT>] [-lrpb] [-lrsub <arg>] [-debug]
[-h] [-v]
-l,--left <FILE FILE ...> left reads file(s)
-r,--right <FILE FILE ...> right reads file(s)
-pool <FILE> list of read files for pooled assembly
-long <FILE FILE ...> long reads file(s)
(Requires `minimap2` and `racon` in
your environment. Presets `-k 25 -c 2
-indel 50 -e 2 -p 0.7 -length 200
-overlap 150 -tip 50 -polya 12` unless
each option is defined otherwise.)
-sef <FILE FILE ...> single-end forward read file(s)
-ser <FILE FILE ...> single-end reverse read file(s)
-ref <FILE FILE ...> reference transcripts file(s) for
guiding the assembly process
-rcl,--revcomp-left reverse-complement left reads [false]
-rcr,--revcomp-right reverse-complement right reads [false]
-rc,--revcomp-long reverse-complement long reads [false]
-ss,--stranded reads are strand specific [false]
-n,--name <STR> assembly name [rnabloom]
-prefix <STR> name prefix in FASTA header for
assembled transcripts
-u,--uracil output uracils (U) in place of thymines
(T) in assembled transcripts [false]
-t,--threads <INT> number of threads to run [2]
-o,--outdir <DIR> output directory
[/media/kazu/8TB6/zDB/rnabloom_assembly
]
-f,--force force overwrite existing files [false]
-k,--kmer <INT> k-mer size [25]
-stage <INT> assembly termination stage
short reads: [3]
1. construct graph
2. assemble fragments
3. assemble transcripts
long reads: [3]
1. construct graph
2. correct reads
3. assemble transcripts
-q,--qual <INT> minimum base quality in reads [3]
-Q,--qual-avg <INT> minimum average base quality in reads
[0]
-c,--mincov <INT> minimum k-mer coverage [1]
-hash <INT> number of hash functions for all Bloom
filters [2]
-sh,--sbf-hash <INT> number of hash functions for screening
Bloom filter [2]
-dh,--dbgbf-hash <INT> number of hash functions for de Bruijn
graph Bloom filter [2]
-ch,--cbf-hash <INT> number of hash functions for k-mer
counting Bloom filter [2]
-ph,--pkbf-hash <INT> number of hash functions for paired
k-mers Bloom filter [2]
-nk,--num-kmers <INT> expected number of unique k-mers in
input reads
-ntcard count unique k-mers in input reads with
ntCard [false]
(Requires `ntcard` in your environment.
Turns on automatically if `-nk` is not
specified and `ntcard` is in your
environment.)
-mem,--memory <DECIMAL> total amount of memory (GB) for all
Bloom filters [auto]
-sm,--sbf-mem <DECIMAL> amount of memory (GB) for screening
Bloom filter [auto]
-dm,--dbgbf-mem <DECIMAL> amount of memory (GB) for de Bruijn
graph Bloom filter [auto]
-cm,--cbf-mem <DECIMAL> amount of memory (GB) for k-mer
counting Bloom filter [auto]
-pm,--pkbf-mem <DECIMAL> amount of memory (GB) for paired kmers
Bloom filter [auto]
-fpr,--fpr <DECIMAL> maximum allowable false-positive rate
of Bloom filters [0.01]
-savebf save graph (Bloom filters) from stage 1
to disk [false]
-tiplength <INT> maximum number of bases in a tip [auto]
-lookahead <INT> number of k-mers to look ahead during
graph traversal [3]
-sample <INT> sample size for estimating
read/fragment lengths [10000]
-e,--errcorritr <INT> number of iterations of
error-correction in reads [1]
-grad,--maxcovgrad <DECIMAL> maximum k-mer coverage gradient for
error correction [0.50]
-indel <INT> maximum size of indels to be collapsed
[1]
-p,--percent <DECIMAL> minimum percent identity of sequences
to be collapsed [0.90]
-length <INT> minimum transcript length in output
assembly [200]
-norr skip redundancy reduction for assembled
transcripts [false]
(will not create 'transcripts.nr.fa')
-mergepool merge pooled assemblies [false]
(Requires `-pool`; overrides `-norr`)
-overlap <INT> minimum number of overlapping bases
between reads [k-1]
-bound <INT> maximum distance between read mates
[500]
-extend extend fragments outward during
fragment reconstruction [false]
-nofc turn off assembly consistency with
fragment paired k-mers [false]
-sensitive assemble transcripts in sensitive mode
[false]
-artifact keep potential sequencing artifacts
[false]
-chimera keep potential chimeras [false]
-stratum <01|e0|e1|e2|e3|e4|e5> fragments lower than the specified
stratum are extended only if they are
branch-free in the graph [e0]
-pair <INT> minimum number of consecutive k-mer
pairs for assembling transcripts [10]
-a,--polya <INT> prioritize assembly of transcripts with
poly-A tails of the minimum length
specified [0]
-mmopt <OPTIONS> options for minimap2 ["'-K 250M -e 25
-f 0.0001 -c'"]
(`-x` and `-t` are already in use)
-lrop <DECIMAL> minimum proportion of matching bases
within long-read overlaps [0.80]
-lrrd <INT> min read depth required for long-read
assembly [3]
-lrpb use PacBio presets [false].
(Used in conjunction with `-long`
option. Presets `-k35 -indel 30 -tip 10
-p 0.8 -lrop 0.9` unless each option is
defined otherwise.)
-lrsub <arg> subsample long reads before assembly
using strobemers (depth,s,size,window)
or k-mer pairs (depth,k,size)
[3,s,11,50]
-debug print debugging information [false]
-h,--help print this message and exits
-v,--version print version information and exits
> rnabloom -v
（v.1系ではないか注意すること）
実行方法
１、ショートリード
FASTQまたはFASTAフォーマットのリードを指定する。GZIP圧縮にも対応している。
#single-end
rnabloom -sef SE.fastq -t 20 -outdir OUTDIR
#paired-end; 左リードがセンスで右リードがアンチセンスの場合、右リードは-revcomp-rightを使用（逆補完）
rnabloom -l LEFT.fastq -rcr RIGHT.fastq -t 20 -outdir OUTDIR
#左リードがアンチセンスで右リードがセンスの場合、左リードは-revcomp-leftを使用（逆相補）
rnabloom -rcl LEFT.fastq -r RIGHT.fastq -t 20 -outdir OUTDIR
#single-end & paired-end
rnabloom -l LEFT.fastq -r RIGHT.fastq -revcomp-right -sef SE.fastq -t 20 -outdir OUTDIR
-
-t number of threads to run [2]
-
-o output directory
-
-sef single-end forward read file(s)
-
-ser single-end reverse read file(s)
-
-rcl reverse-complement left reads [false]
-rcr reverse-complement right reads [false]
-
-l left reads file(s)
-
-r right reads file(s)
-
--stranded reads are strand specific [false]
出力例
rnabloom.transcripts.fa；長さの閾値より長いアセンブルされたトランスクリプト
rnabloom.transcripts.short.fal長さの閾値よりも短いアセンブルされたトランスクリプト
rnabloom.transcripts.nr.fa；冗長性を減らしたアセンブルされたトランスクリプト
２、ロングリード
ロングリードのアセンブリにも対応している。デフォルトプリセットはONTデータ用となっている。PacBioデータには-lrpbフラグを追加する。
#順方向と逆方向の両方のリードが混在
rnabloom -long LONG.fastq -t 20 -outdir OUTDIR
#nanopore direct RNA seq。入力されたリードは、順方向のみと想定
rnabloom -long LONG.fastq -stranded -t 20 -outdir OUTDIR
#デフォルトでは、ウラシル(U)はTとして記述される。出力アセンブリにTの代わりにUを記述するには、-uracilオプションを使用する（レポジトリより）
-
-long long reads file(s) (Requires `minimap2` and `racon` in your environment. Presets `-k 25 -c 2 -indel 50 -e 2 -p 0.7 -length 200 -overlap 150 -tip 50 -polya 12` unless each option is defined otherwise.)
-
-lrpb use PacBio presets [false]. (Used in conjunction with `-long` option. Presets `-k35 -indel 30 -tip 10 -p 0.8 -lrop 0.9` unless each option is defined otherwise.)
-
-lrsub <arg> subsample long reads before assembly using strobemers (depth,s,size,window) or k-mer pairs (depth,k,size) [3,s,11,50]
３、ショートリードで研磨したロングリードシーケンスデータをアセンブルする。
#cDNA long read
rnabloom -long LONG.fastq -sef SHORT.fastq -t THREADS -outdir OUTDIR
#nanopore direct RNA seq
rnabloom -stranded -long LONG.fastq -sef SHORT_FORWARD.fastq -ser SHORT_REVERSE.fastq -t THREADS -outdir OUTDIR
- 入力リードがstrand-specificである場合（上手くシークエンシングできていることも確認できた場合）、"--stranded"オプションをつけると、strand-specificなアセンブルに対応する。リードの向きなどはレポジトリを参照。
- シングルセルデータのアセンブルにも対応している。対応しているデータと使い方についてはレポジトリで説明されている。
- ガイドアセンブリを行うには、"-ref"オプションで参照するトランスクリプトームのfastaファイルを指定する。現時点では、ロングリードデータ（-long）ではガイドアセンブリに対応していない。
- ロングリードのアセンブリにも対応しているが、ロングリードでは、アセンブリ前にPorechopなどを使ってリードのアダプターをトリミングすることが強く推奨されている。
- レポジトリでは、ブルームフィルタのサイズやJAVAのメモリ指定なども説明されている。
引用
Reference-free assembly of long-read transcriptome sequencing data with RNA-Bloom2
Ka Ming Nip, Saber Hafezqorani, Kristina K. Gagalova, Readman Chiu, Chen Yang, René L. Warren & Inanc Birol
Nature Communications volume 14, Article number: 2940 (2023)
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