バクテリアゲノムデータセットからリンクされた遺伝子を探す SLING

　オペロンおよび機能的に連結された遺伝子アレイは原核生物ゲノムにおける転写構成の最も基本的な単位を表す。同じプロセスまたはパスウエイに関与する遺伝子は単一のブロックにコードされ、同じ調節の下で転写される。多くの臨床的に重要な遺伝子システムがオペロンにコードされている。すべての分泌システム、CRISPR-casシステム、Resistance Nodulation Division（RND）排出ポンプ、毒素抗毒素（TA）システムなどがこれに従っている。

　同様の機能を有するオペロンおよび遺伝子アレイの構造は、単離体および種によって実質的に異なり得る。遺伝子の順序はしばしば変更され、個々の遺伝子は失われるかまたは獲得されるかもしれない。これらの違いはすべて、大規模データセットのゲノム間での比較を複雑にしている。これらの問題を解決するために、特定のオペロンにアノテーションを付ける洗練された方法が開発されてきた（ref.3,11–14）。これらのツールは、以前に定義された構造および配列に頼るか、または新しい遺伝的構造同定のために再プログラミングを必要とするので、特定のオペロンに限定される。あるいは、バクテリアゲノム中のすべてのオペロンを予測するためのツールが開発され、データベースを構築するために使用されてきた（ref.15–18）。これらのツールの多くはゲノムアノテーションファイルから検索するため、コーディングシーケンスが非常に短いために自動アノテーションプログラムで認識されないと、システムは観察されないままになる。重要な病原体のサーベイランスのため大規模データセットの利用可能性が高まっているため（ref.19–21）、幅広い分離株を臨床的に関連のある遺伝子アレイにアノテーションし、それらの多様性を調べるための単一の柔軟な枠組みが必要である。

ここではSLINGというLINKed Genesを検索するためのツールを紹介する。SLINGは、規則的に定義された近接性および方向性で、隣接配列とともに単一の保存された遺伝子として遺伝子配列を定義する。この定義により、SLINGは単離株にわたる遺伝子アレイの潜在的な多様性を捉えることができ、それらの多様性を同定し研究することができる。例えば、RND排出オペロンは常にRND排出ポンプタンパク質を含み、これはしばしば膜融合タンパク質の下流に位置する（ref.6）。毒素抗毒素（TA）システムでは、毒素タンパク質はその同族の抗毒素に近接してコードされている。SLINGを使用して、著者らは、（ref.22）から選択された70の腸病原性大腸菌（EPEC）ゲノムおよび選択された大腸菌参照株ゲノムからなる既存のデータセットにおいて、これら２つのオペロンを同定および特徴付けした。著者らは、単離系統学におけるこれらのシステムの分布ならびにそれらの遺伝的構成要素の多様性について洞察を得、特定の系統との関連を同定し、完全なアレイまたはそれらの構成要素全体にわたる構成要素の喪失または獲得のパターンについてより深い理解を得た。

wiki

https://github.com/ghoresh11/sling/wiki

インストール

mambaでpython2.7の環境を作ってテストした（計算にはubuntu18.04の計算機を使用）。

依存

sling has the following dependencies which need to be installed:

• python version >= 2.7.13
• HMMER version >= 3.1b2
• BLAST+ version >= 2.6.0

本体　Github

git clone https://github.com/ghoresh11/sling.git
cd sling
pip install .

> sling

$ sling    

Usage: sling <command> <required arguments> [options]

To get minimal usage for a command use: sling command

To get full help for a command use one of: sling command -h OR sling command --help

Available commands:

run Run the complete search strategy on the input genomes

prepare Process the input genomes (in FASTA format, and optionally GFF format) for use by the following tasks.

scan Scan the ORFs from the preparation step using HMMER for profile collection

filter Summarise and filter the scanning results to identify hits that meet the structure requirements

group Group all hit and partner ORFs using sequence similarity networks

create_db Add custom HMM collection and requirements as built into SLING

view_dbs See list of avaiable built-in collections and their parameters

version Print version and exit

> sling run -h

$ sling run -h

usage: sling run [options] <run_id> <input_dir> <hmm_db> 

Run the full search strategy

positional arguments:

  PATH                  Directory to save all result files

  PATH                  Name of directory containing FASTA files

  STR/FILE              Name of the predefined HMM database ['toxins',

                        'RND_pump'] OR path to custom HMM file

optional arguments:

  -h, --help            show this help message and exit

  -fs STR, --fasta_suffix STR

                        Suffix of FASTA files in <input_dir> [.fasta]

  -gd PATH, --gff_dir PATH

                        Name of directory containing GFF files. [<input_dir>]

  -gs STR, --gff_suffix STR

                        Suffix of GFF files in <gff_dir> [.gff]

  -mol INT, --min_orf_length INT

                        Minimun length of an open reading frame [20]

  -c INT, --cpu INT     Number of CPUs to be used [1]

  -ct STR, --codon_table STR

                        Codon table to use in translation [Standard]

  -sc STR, --start_codons STR

                        Accepted start codons written in hierarchical order of

                        usage [atg,gtg,ttg]

  -o PATH, --out_dir PATH

                        Directory for all the output files

  --hmmsearch STR       HMM search executable (set to hmmscan if wish to run

                        scan not search) [Default: hmmsearch]

  --hmmpress STR        HMM press executable [relevant for hmmscan only]

                        [Default: hmmpress]

  -u, --report_unfit    Generate reports for HMMER hits that did not meet

                        requirements [False]

  -mhl INT, --min_hit_length INT

                        Minimum length of a hit, if not in DOMAINS file [1]

  -Mhl INT, --max_hit_length INT

                        Maximum length of a hit, if not in DOMAINS file

                        [10000000]

  -mul INT, --min_upstream_length INT

                        Minimum length of the upstream gene [1]

  -Mul INT, --max_upstream_length INT

                        Maximum length of the upstream gene [10000000]

  -mdl INT, --min_downstream_length INT

                        Minimum length of the downstream gene [1]

  -Mdl INT, --max_downstream_length INT

                        Maximum length of the downstream gene [10000000]

  -Mo INT, --max_overlap INT

                        Maximum overlap between two operon proteins [300]

  -Md INT, --max_distance INT

                        Maximum distance between two opern proteins [10000000]

  -mhs FLOAT, --min_hmmscan_score FLOAT

                        Minimum HMMER score to use for significant hits [20]

  -t STR, --order STR   Location of partner gene relative to hit. Options:

                        upstream, downstream, either, both [either]

  -s PATH, --sep PATH   Delimiter to use in the output file [,]

  -di FILE, --domains_to_ignore FILE

                        File with line delemited hmmer domains to ignore in

                        summary

  -df FILE, --domains_file FILE

                        Tab delimited file of HMMER domains and the expected

                        length of their hits

  -Mda INT, --max_diff_avg_length INT

                        Maximum difference between hit length and its average

                        length defined in <domains_file> [10000000]

  -it, --save_to_ITOL   Generate files that can be loaded into ITOL [False]

  -mbe INT, --min_blast_evalue INT

                        Minimum BLAST evalue to use for an edge in the

                        sequence similarity network [0.01]

  -mi INT, --min_identity INT

                        Minimum BLAST identity to use for an edge in the

                        sequence similarity network [30]

  --makeblastdb STR     makeblastdb executable [makeblastdb]

  --blastp STR          blastp executable [blastp]

実行方法

GFFファイル（full）を指定する。ITOLにロードするためのファイルも作成する。

sling run id genomes/ toxins -u --itol -c 12 -o outdir

• --itol    flag states that files should be created to load into ITOL.
• -c   Number of CPUs to be used [1]

• -u   Generate reports for HMMER hits that did not meet requirements [False]

• -o    Directory for all the output files

デフォルトではtozin antitoxinデータベースのHMMプロファイルが組み込まれており、このデータベースをtoxinsで選択している。u フラグをつけると廃棄されたヒットが報告される。

ステップ・バイ・ステップ

1. prepare：検索用のFASTAファイル（およびオプションのGFFファイル）を処理する。
2. scan: HMMERを使ってHMMプロファイルのためにORFをスキャンする。
3. filter: スキャン結果をフィルタリングし、各ストレインにアノテーションを付ける。
4. group：配列類似性ネットワークを使って、結果をグループ化する。

sling runは１－４を全て実行する。ステップ・バイ・ステップは、パラメータを変えながら、各ステップを繰り返しランする際に便利。

 出力

出力内容についてはwikiで詳細に説明されています。wikiを確認して下さい。

--itolをつけてSLINGをランし、結果のid_GROUP/ITOL/のtxtファイル（wiki）をiTOLにドラッグして視覚化した。使用している系統樹ファイルは、（同じGFFから）roaryで連結コア遺伝子アラインメントを作成し、Fasttreeの近似法で系統推定することで得た。

iTOLでは、系統樹ファイルを読み込ませたて可視化後、画面上にメタデータファイルをドラッグ&ドロップするとメタデータが視覚化される。ここではhits.txt（各ゲノムにおける各ヒットクラスタ数のmatrix）を読み込んでいる。同じデータはid_GROUP/のCSVファイルにもあり、ITOL/のtxtファイルはiTOL読み込み用となる。

引用

SLING: a tool to search for linked genes in bacterial datasets
Gal Horesh Alexander Harms Cinzia Fino Leopold Parts Kenn Gerdes Eva HeinzNicholas Robert Thomson

Nucleic Acids Research, Volume 46, Issue 21, 30 November 2018, Pages e128

関連