環境メタゲノムシーケンシングは、多くの課題を提起する。第一に、複雑な土壌マトリックスと強靭な生物は、デオキシリボ核酸（DNA）とリボ核酸（RNA）の抽出を妨げる[論文より ref.1]。第2に、低バイオマス試料は、汚染の可能性も高める、さらなる抽出および濃縮ステップを必要とする[ref.2]。第3に、ターゲット増幅（例えば、16S rRNAアンプリコン）が分類学的分解能を低下させる一方で、全ゲノム増幅は集団にバイアスを起こすことがある[ref.3]。これらの課題に対処するために、著者らは低バイオマス難分解性サンプルに適合し、溶解するのが困難な生物の抽出プロトコールを開発した[ref.5]（pubmed）。 Bacillus subtilisの難溶性胞子を用いて開発されたこれらのプロトコールは、遠心分離を行わずに2×10 5細胞/ gの土壌を含む50mgのサンプルから少なくとも5％の抽出収率を達成している[ref.6]。さらに、増幅バイアスおよびさらなる汚染を回避するため、低入力量の標的DNA（枯草菌）をシャトルするゲノム担体（腸内細菌ファージλ） [ref7]を使い、ライブラリー調製および理想的なstoichiometryを調べる実験を行った。このアプローチにより、Oxford Nanopore Technologies（ONT）Minionシーケンサーを使い、1000ngのラムダDNAを用いて調製したBacillus subtilis DNAを0.2ngまで検出することができた。
この論文では、キャリア配列決定法を用いて、標的DNAをゲノム担体で調製して低入力DNAを配列し、理想的なライブラリー調製およびstoichiometryで増幅せずにシーケンシングする方法を採用する。 次に、シーケンス解析ワークフローであるCarrierSeqを使用して、ゲノムキャリアからの低入力ターゲットリードを特定する。 著者らは1000ngのエンテロバクテリアファージλDNAのバックグラウンドにおける0.2ngのBacillus subtilis ATCC 6633 DNAの組み合わせからの配列決定によりCarrierSeqを実験的に試験した。キャリアのリードや低クオリティでlow complexityなリード（ONTのジャンク）をフィルタリグした後、ターゲットリード（枯草菌）、コンタミネーションリード、および high quality noise reads（HQNR）を検出した。 これらのリードは、それらが特定のチャネル（細孔）と関連しており、ナノポア配列決定プロセスのアーティファクトのように見える。
CarrierSeqはbwa-mem [ref.8]を実装して、最初にすべてのリードをゲノムキャリアにマップし、次にsamtools [9]とseqtk [10]を使用してマッピングされていないリードを抽出する。 その後、CarrierSeqは品質スコアのしきい値を定義して（phread quality score ≥ 9）、低複雑度のリード[11]をfqtrim [12]を使い破棄する。 このアンマップかつフィルタリングされて残ったリードセットは、reads of interest（ROI）とラベルされ、ROIは理論的にはターゲットリードと汚染由来リードの可能性がある。 ただし、ROIには、クオリティスコアと複雑さのフィルタは満たしてしまうが、いかなるデータベースとも一致しない、特定のチャネルからの不均衡な読み取りとして定義されるhigh-quality noise reads（HQNR）も含まれる。 リードをPoisson arrival processとして扱うことで、CarrierSeqは期待されるROIチャネルの分布をモデル化し、リード/チャネルのしきい値（xcrit）を超えるチャネルからのデータを拒否する。
example dataset
https://figshare.com/articles/Example_carrier_sequencing_fastQ_data_set_for_CarrierSeq/5868825/1
インストール
依存
- Biopython - http://biopython.org/
- SciPy - https://www.scipy.org/
- bwa - https://github.com/lh3/bwa
- seqtk - https://github.com/lh3/seqtk
- samtools - https://github.com/samtools/samtools
- fqtrim - https://ccb.jhu.edu/software/fqtrim/
dockerコンテナで導入する。
docker pull mojarro/carrierseq:latest
#イメージの確認
docker images
#コンテナの作成と起動
docker run mojarro/carrierseq
#ここでは共有ディレクトリ~/nanoporeをコンテナの/homeと共有指定して起動する。
docker run -i -t -v ~/nanopore/:/home mojarro/carrierseq
#抜けるには"control + P、Q"。起動しているか確認は"docker ps -a"。
#、再度ログインするには"docker attach <CONTAINER ID>"
本体 Github
https://github.com/amojarro/carrierseq
git clone https://github.com/amojarro/carrierseq.git
cd carrierseq/
chmod +x carrierseq.sh
> ./carrierseq.sh
$ ./carrierseq.sh
Usage: carrierseq.sh options [-i INPUT] [-r REFERENCE] [-o OUTPUT] are required. Use -h for help
user-no-MacBook-Pro-2:carrierseq user$ ./carrierseq.sh -h
./carrierseq.sh: illegal option -- h
Usage: carrierseq.sh [-i INPUT] [-r REFERENCE] [-o OUTPUT]...
CarrierSeq requires bwa, samtools, seqtk, fqtrim, and biopython.
Reads to be analyzed must be compiled into a single fastq file and the reference genome must be in fasta format.
-i All reads to be analyzed *.fastq
-r Carrier reference genome *.fasta
-t Number of threads used for BWA mapping (default = 1)
-q User-defined quality (phred) score (default = 9)
-p User-defined p-value
(default = ~0.0001 or 0.05 / 512 active channels)
-o Output directory
ラン
./carrierseq.sh -i inout.fastq -r ref.fasta -o out -t 24 -q 9
- -i All reads to be analyzed *.fastq
- -r Carrier reference genome *.fasta
- -t Number of threads used for BWA mapping (default = 1)
- -q User-defined quality (phred) score (default = 9)
- -p User-defined p-value (default = ~0.0001 or 0.05 / 512 active channels)
進捗とともに新しいディレクトリが作成され、最終的に合計９つのディレクトリができる。
07がhqnrsとして定義された、クオリティが高くlow compxilityな配列構造になっていないが、いかなるデータベースとも相同性を示さないおそらくジャンクの配列である。ROIとして残ったfastqのうち、しきい値を超えたチャネルからの出力がここに振り分けられる。
論文の著者らの実験では、0.2 ngの B. subtilis DNAを1µgのLambda DNAと混ぜ、MinionのR.94フローセルで48hシーケンスしAlbacore v1でベースコールしている。スループットは6,4GBの717,432リードで、そこからLambdaゲノムにマッピングして、ROIを1811リード得ている。そのうちhqnrsと判定されたリードは1179で、True positive（08のディレクトリ）は632リードだった。自分でもテストデータをダウンロードして、CarrierSeqを使いhqnrsを抽出し、blastn解析してみた。数リードだけE.coliゲノムと高い相同性を示したが、およそ8-9割のリードはblastnでヒットした配列がゼロだった。
hqnrsが本当にアーティファクトのリードであるならば、低クオリティなリードとして出力されるべきだが、Oxfordナノポアはタンパク質をセンサーの中心に使っているので、均一なフローセル作成が難しく歩留まりは高くない。したがって厳密なクオリティ評価も困難と思われる。ONTのシーケンス解析では、この論文の手法のようなクオリティスコアだけに依存しないpreprocessing手法を考える必要がある。本当のシーケンスリードであることを担保しないまま進めると、環境ゲノムから得た新種のゲノムだと考えていた配列が、実はジャンクだったということにもなりかねない。そしてこれはデータベースの汚染を引き起こす問題でもある。
引用
CarrierSeq: a sequence analysis workflow for low-input nanopore sequencing.
BMC Bioinformatics. 2018.
Mojarro A, Hachey J, Ruvkun G, Zuber MT, Carr CE
