病原性細菌の迅速な分子タイピングは、公衆衛生疫学、サーベイ ランスおよび感染制御にとって重要である[論文より ref.1,2]。そのような活動の2つの重要な目標は、（1）病原性遺伝子、抗菌性耐性遺伝子または血清型決定因子を含む臨床的に関連する表現型に関連する遺伝子の存在を検出すること、 （2）MLST [ref.3]またはクローン特異的または他の疫学マーカーの検出を介して、分離株をクローン群に分類すること。全ゲノムシーケンシング（WGS）またはゲノム疫学は、これらの作業にますます採用されており、PCR および/または制限酵素消化と、電気泳動 による配列決定またはサイズ分離とを組み合わせた現在の技術を置き換える可能性がある[ ref.4]。 WGSは、（1）生物または標的特異的試薬を必要としない多数の細菌分離株に同時に適用することができる。 （2）結果データは容易に共有可能であり、過去および将来のデータセットと容易に比較することができ、日常的なサーベイランス（遺伝子およびクローンのモニタリング）および詳細なアウトブレイク調査に利用可能である[ref.4]。
WGSは病原体の研究に革命をもたらし、公衆衛生疫学、サーベイランス、感染管理の実践に革命をもたらす可能性がある[ref.4-10]。いくつかの実証研究[ref.11-16]にもかかわらず、WGSの日常的な使用は、公衆衛生および診断研究所にとって重要な課題を提起している。その主なものは、迅速で再現性のある情報抽出、解釈可能、rawシーケンシングデータの扱いである。
現在利用可能な方法は、BLASTまたは他の検索アルゴリズムを用いて目的の遺伝子または対立遺伝子（例えば、ARG-Annot [ref.18]; ResFinder、PlasmidFinderおよびMLSTを同定することができるより長い連続した配列（コンティグ）へショートリードをアセンブリすることに依存している[ref.19-21]; BIGSdb [ref.22-23]）。アセンブリへの依存は、ショートリードから高品質の細菌ゲノムアセンブリを生成するためのデータ、時間、および計算上の要求に起因する効率および感度の問題を引き起こす。数ギガバイトのメモリで数時間から数時間で細菌ゲノムアセンブリを生成できるアセンブラがいくつかある（例えば、Velvet [ref.24]、SPAdes [ref.25]）。しかし、これらのツールを用いた高品質のアセンブリの作成には、質の高いフィルタリングやリードの前処理、kmerの長さや他のパラメータの最適化が必要であり、実際にはいくつかの代替アセンブリを生成して比較する必要がある。さらに、高度に最適化されたアセンブリの品質は、マルチプレックスで一緒にシーケンシングされたclosely relatedなゲノムであっても、非常に可変である。したがって、ショートリード技術でアセンブリベースで決定されたゲノムの解析では、公衆衛生および感染対策に使用するための堅牢で信頼性の高い再現性のあるアッセイを確実にするために重要な標準化と品質管理が非常に困難である。
この論文では、ゲノム疫学の新しいツールであるSRST2について説明する。SRST2は、WGSのショートシークエンシングリードから直接的に遺伝子や対立遺伝子を迅速かつ正確に検出する。 SRST2は、任意の配列データベースを使用して読み込みを行い、MLST形式のデータベース[ref.3]で定義されたコンビナトリアルシーケンスタイプを計算することができる。（一部略）
SRST2は、以前のツールSRST（Short Read Sequencing Typing）にちなんで名付けられたが、SRST2は完全に斬新なコードで、SRSTとは異なるリードマッピング、スコアリングとアルゴリズムを使用し、 MLSTと同様に、遺伝子の検出やアレルのタイピングを行う。
Labo HP
SRST2 HP
https://katholt.github.io/srst2/
インストール
ubuntu18.04のpython2.7.14でテストした。
依存
- python (v2.7.5 or later)
- scipy, numpy http://www.scipy.org/install.html
- bowtie2 (v2.1.0 or later) http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml
- SAMtools v0.1.18 https://sourceforge.net/projects/samtools/files/samtools/0.1.18/ (NOTE 0.1.19 DOES NOT WORK)
- (NOTE: later versions can be used, but better results are obtained with v0.1.18, especially at low read depths (<20x))
bowite2の対応バージョンは 2.1.0, 2.2.3, 2.2.4, 2.2.5, 2.2.6, 2.2.7, 2.2.8, 2.2.9のみ。
samtoolsの対応バージョンは 0.1.18, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, (0.1.18 is recommended)
本体 Github
git clone https://github.com/katholt/srst2
pip install srst2/
#動作確認
srst2 --version
getmlst.py -h
slurm_srst2.py -h
> srst2 --version
$ srst2 --version
srst2 0.2.0
kazu@74a7df8f35c0:/data$ srst2 -h
usage: srst2 [-h] [--version] [--input_se INPUT_SE [INPUT_SE ...]]
[--input_pe INPUT_PE [INPUT_PE ...]] [--merge_paired]
[--forward FORWARD] [--reverse REVERSE] [--read_type {q,qseq,f}]
[--mlst_db MLST_DB] [--mlst_delimiter MLST_DELIMITER]
[--mlst_definitions MLST_DEFINITIONS]
[--mlst_max_mismatch MLST_MAX_MISMATCH]
[--gene_db GENE_DB [GENE_DB ...]] [--no_gene_details]
[--gene_max_mismatch GENE_MAX_MISMATCH]
[--min_coverage MIN_COVERAGE] [--max_divergence MAX_DIVERGENCE]
[--min_depth MIN_DEPTH] [--min_edge_depth MIN_EDGE_DEPTH]
[--prob_err PROB_ERR]
[--truncation_score_tolerance TRUNCATION_SCORE_TOLERANCE]
[--stop_after STOP_AFTER] [--other OTHER]
[--max_unaligned_overlap MAX_UNALIGNED_OVERLAP] [--mapq MAPQ]
[--baseq BASEQ] [--samtools_args SAMTOOLS_ARGS] --output OUTPUT
[--log] [--save_scores] [--report_new_consensus]
[--report_all_consensus] [--use_existing_bowtie2_sam]
[--use_existing_pileup] [--use_existing_scores]
[--keep_interim_alignment] [--threads THREADS]
[--prev_output PREV_OUTPUT [PREV_OUTPUT ...]]
SRST2 - Short Read Sequence Typer (v2)
optional arguments:
-h, --help show this help message and exit
--version show program's version number and exit
--input_se INPUT_SE [INPUT_SE ...]
Single end read file(s) for analysing (may be gzipped)
--input_pe INPUT_PE [INPUT_PE ...]
Paired end read files for analysing (may be gzipped)
--merge_paired Switch on if all the input read sets belong to a
single sample, and you want to merge their data to get
a single result
--forward FORWARD Designator for forward reads (only used if NOT in
MiSeq format sample_S1_L001_R1_001.fastq.gz; otherwise
default is _1, i.e. expect forward reads as
sample_1.fastq.gz)
--reverse REVERSE Designator for reverse reads (only used if NOT in
MiSeq format sample_S1_L001_R2_001.fastq.gz; otherwise
default is _2, i.e. expect forward reads as
sample_2.fastq.gz
--read_type {q,qseq,f}
Read file type (for bowtie2; default is q=fastq; other
options: qseq=solexa, f=fasta).
--mlst_db MLST_DB Fasta file of MLST alleles (optional)
--mlst_delimiter MLST_DELIMITER
Character(s) separating gene name from allele number
in MLST database (default "-", as in arcc-1)
--mlst_definitions MLST_DEFINITIONS
ST definitions for MLST scheme (required if mlst_db
supplied and you want to calculate STs)
--mlst_max_mismatch MLST_MAX_MISMATCH
Maximum number of mismatches per read for MLST allele
calling (default 10)
--gene_db GENE_DB [GENE_DB ...]
Fasta file/s for gene databases (optional)
--no_gene_details Switch OFF verbose reporting of gene typing
--gene_max_mismatch GENE_MAX_MISMATCH
Maximum number of mismatches per read for gene
detection and allele calling (default 10)
--min_coverage MIN_COVERAGE
Minimum %coverage cutoff for gene reporting (default
90)
--max_divergence MAX_DIVERGENCE
Maximum %divergence cutoff for gene reporting (default
10)
--min_depth MIN_DEPTH
Minimum mean depth to flag as dubious allele call
(default 5)
--min_edge_depth MIN_EDGE_DEPTH
Minimum edge depth to flag as dubious allele call
(default 2)
--prob_err PROB_ERR Probability of sequencing error (default 0.01)
--truncation_score_tolerance TRUNCATION_SCORE_TOLERANCE
% increase in score allowed to choose non-truncated
allele
--stop_after STOP_AFTER
Stop mapping after this number of reads have been
mapped (otherwise map all)
--other OTHER Other arguments to pass to bowtie2 (must be escaped,
e.g. "\--no-mixed".
--max_unaligned_overlap MAX_UNALIGNED_OVERLAP
Read discarded from alignment if either of its ends
has unaligned overlap with the reference that is
longer than this value (default 10)
--mapq MAPQ Samtools -q parameter (default 1)
--baseq BASEQ Samtools -Q parameter (default 20)
--samtools_args SAMTOOLS_ARGS
Other arguments to pass to samtools mpileup (must be
escaped, e.g. "\-A").
--output OUTPUT Prefix for srst2 output files
--log Switch ON logging to file (otherwise log to stdout)
--save_scores Switch ON verbose reporting of all scores
--report_new_consensus
If a matching alleles is not found, report the
consensus allele. Note, only SNP differences are
considered, not indels.
--report_all_consensus
Report the consensus allele for the most likely
allele. Note, only SNP differences are considered, not
indels.
--use_existing_bowtie2_sam
Use existing SAM file generated by Bowtie2 if
available, otherwise they will be generated
--use_existing_pileup
Use existing pileups if available, otherwise they will
be generated
--use_existing_scores
Use existing scores files if available, otherwise they
will be generated
--keep_interim_alignment
Keep interim files (sam & unsorted bam), otherwise
they will be deleted after sorted bam is created
--threads THREADS Use multiple threads in Bowtie and Samtools
--prev_output PREV_OUTPUT [PREV_OUTPUT ...]
SRST2 results files to compile (any new results from
this run will also be incorporated)
> getmlst.py -h
$ getmlst.py -h
usage: getmlst.py [-h] [--repository_url URL] --species NAME
[--force_scheme_name]
Download MLST datasets by speciesfrom pubmlst.org.
optional arguments:
-h, --help show this help message and exit
--repository_url URL URL for MLST repository XML index
--species NAME The name of the species that you want to download
(e.g. "Escherichia coli")
--force_scheme_name Flage to force downloading of specific scheme name
(e.g. "Clostridium difficile")
> slurm_srst2.py -h
$ slurm_srst2.py -h
usage: slurm_srst2.py [-h] [--walltime WALLTIME] [--memory MEMORY]
[--rundir RUNDIR] [--threads THREADS] --script SCRIPT
--output OUTPUT [--input_se INPUT_SE [INPUT_SE ...]]
[--input_pe INPUT_PE [INPUT_PE ...]] [--forward FORWARD]
[--reverse REVERSE] --other_args OTHER_ARGS
Submit SRST2 jobs through SLURM
optional arguments:
-h, --help show this help message and exit
--walltime WALLTIME wall time (default 0-1:0 = 1 h)
--memory MEMORY mem (default 4096 = 4gb)
--rundir RUNDIR directory to run in (default current dir)
--threads THREADS number of CPUs per job
--script SCRIPT path to srst2.py
--output OUTPUT identifier for outputs (will be combined with read set
identifiers)
--input_se INPUT_SE [INPUT_SE ...]
Single end read file(s) for analysing (may be gzipped)
--input_pe INPUT_PE [INPUT_PE ...]
Paired end read files for analysing (may be gzipped)
--forward FORWARD Designator for forward reads (only used if NOT in
MiSeq format sample_S1_L001_R1_001.fastq.gz; otherwise
default is _1, i.e. expect forward reads as
sample_1.fastq.gz)
--reverse REVERSE Designator for reverse reads (only used if NOT in
MiSeq format sample_S1_L001_R2_001.fastq.gz; otherwise
default is _2, i.e. expect forward reads as
sample_2.fastq.gz)
--other_args OTHER_ARGS
string containing all other arguments to pass to srst2
またはdockerイメージを使う。対応するsamtoolsやbowtie2のバージョンが古いので、仮想環境で走らす方が無難です。
docker pull estrain/srst2
#ホストのカレントと/dataをシェアしてラン
docker run -itv $PWD:/data/ estrain/srst2
> srst2 -h
データベースの準備
fastaファイルのデータベースを準備する。準備されているスクリプトを使えば、PubMLST（リンク）から自動でダウンロードできる。検出対象の種を指定する。
getmlst.py --species "Escherichia coli#1"
#e.coliは#1と#2の二つあると警告が出たのでここでは#1とした。詳細はPubMLSTで確認
複数のファイルがダウンロードされる。
Escherichia_coli.fasta
user$ head -15 Escherichia_coli.fasta
>adk_1
GGGGAAAGGGACTCAGGCTCAGTTCATCATGGAGAAATATGGTATTCCGCAAATCTCCAC
TGGCGATATGCTGCGTGCTGCGGTCAAATCTGGCTCCGAGCTGGGTAAACAAGCAAAAGA
CATTATGGATGCTGGCAAACTGGTCACCGACGAACTGGTGATCGCGCTGGTTAAAGAGCG
CATTGCTCAGGAAGACTGCCGTAATGGTTTCCTGTTGGACGGCTTCCCGCGTACCATTCC
GCAGGCAGACGCGATGAAAGAAGCGGGCATCAATGTTGATTACGTTCTGGAATTCGACGT
ACCGGACGAACTGATTGTTGATCGTATCGTAGGCCGCCGCGTTCATGCGCCGTCTGGTCG
TGTTTATCACGTTAAATTCAATCCGCCGAAAGTAGAAGGCAAAGACGACGTTACCGGTGA
AGAACTGACTACCCGTAAAGACGATCAGGAAGAAACCGTACGTAAACGTCTGGTTGAATA
CCATCAGATGACTGCACCGCTGATCGGCTACTACTCCAAAGAAGCGGAAGCGGGTA
>adk_2
GGGGAAAGGGACTCAGGCTCAGTTCATCATGGAGAAATATGGTATTCCGCAAATCTCCAC
TGGCGATATGCTGCGTGCTGCGGTCAAATCTGGCTCCGAGCTGGGTAAACAAGCAAAAGA
CATTATGGATGCTGGCAAACTGGTTACCGACGAACTGGTGATCGCGCTGGTTAAAGGGCG
CATTGCTCAGGAAGACTGCCGTAATGGTTTCCTGTTGGACGGCTTCCCGCGTACCATTCC
GCAGGCAGACGCGATGAAAGAAGCGGGCATCAATGTTGATTACGTTCTGGAATTCGACGT
実行方法
ペアエンドfastqを指定する。
srst2 --input_pe ERR024070*.fastq.gz --output shigella1 --log --save_scores --mlst_db Escherichia_coli#1.fasta --mlst_definitions ecoli.txt --gene_db ARGannot.fasta
複数のファイルが出力される。
結果
拡大
オーサーらの解説には、複数データを指定する方法、結果をヒートマップで出力するRのコード（論文のFig.8）も説明されています。
引用
SRST2: Rapid genomic surveillance for public health and hospital microbiology labs
Inouye M, Dashnow H, Raven LA, Schultz MB, Pope BJ, Tomita T, Zobel J, Holt KE
Genome Med. 2014 Nov 20;6(11):90
