2020 4/29 実行手順修正
細菌および古細菌での完全なメタゲノムアセンブリゲノム（MAG）の新規生成は、マイクロバイオーム研究における長年の目標である。既存のメタゲノムシーケンスおよびアセンブリ法では通常、完成した細菌ゲノムシーケンスが得られないため、類似のコンティグをグループ化または「ビニング」することでゲノムドラフトが形成される。このアプローチは、細菌ゲノムの膨大なコレクションを生み出し、微生物の世界に対する認識を大幅に拡大した。
ビニングの品質は、主に基礎となるアセンブリのサイズと連続性に依存する。アセンブリの連続性が高まると、各ゲノムを形成するためにグループ化する必要があるコンティグが少なくなり、より大きくなるため、ゲノムビニングの感度と特異性が向上する。リードクラウドシーケンスを含むシーケンスおよびアセンブリテクノロジーの進歩により、MAGの品質は向上している。しかし、繰り返しシーケンスを正しく配置する能力には限界がある。
repetititve elementsのサイズは、数十塩基対から数百キロベースまでの範囲に及ぶ。ロングリードは、ミニチュア逆方向反復配列転移因子、トランスポゾン、遺伝子複製、プロファージ配列などの一般的な反復因子全体に及ぶことがある。最近、ナノポアおよびPacBioロングリードアセンブリが腸内細菌叢およびその他の微生物叢に適用された。しかし、腸内細菌叢を分析するためのロングリードの適用は、便から高分子量（HMW）DNAを抽出する効率的な方法の欠如により妨げられてきた。標準的なビードビーティングは広範囲のせん断をもたらす可能性があり、固相可逆固定化（SPRI）ビードの「クリーンアップ」ステップは数百塩基対の低いDNAフラグメントを除去するが、多くの場合、バクテリア全体をスキャホールドするのに十分な大きさのDNAフラグメントを濃縮できない。穏やかなビードビーティングはせん断を減らすことができるが、溶解が困難な生物からDNAを抽出できない場合がある。したがって、ゲノムアセンブリの限界を克服するために、グラム陽性菌とグラム陰性菌の両方から反復エレメントにまたがるDNAの長い断片を抽出する方法が必要である。
DNA抽出およびゲノムアセンブリのプロトコルを含む、糞便サンプルのナノポアシーケンスのワークフローを示す（論文補足図1）。本DNA抽出プロトコルは、培養バクテリアの抽出方法から適応されており、溶解酵素のカクテルによる細胞壁の酵素分解、フェノール-クロロホルム抽出、その後のRNAse AおよびプロテイナーゼK消化、重力カラム精製、およびSPRIサイズ選択を含む。このアプローチにより、わずか300mgの糞便からロングリードシーケンシングに適したマイクログラム量の純粋なHMW DNAが生成される。このバイオインフォマティクスワークフローであるLatheは、最近報告されたOPERA-MSなどのハイブリッドアセンブリメソッドではなく、ロングリードアセンブリベースのアプローチを使用している。ナノポアまたはPacBioテクノロジーのいずれかによって、入力されたロングリードデータを生成できる。 Latheは、ベースコーリング、ロングリードアセンブリ、およびポリッシングの既存の手順と、ミスアセンブリ検出およびゲノム環状化（メソッド）の洗練されたアプローチを組み合わせている。
インストール
#condaでsnakemakeの仮想環境を作り、そこにlatheを導入
conda create -n snakemake -y
conda activate snakemake
#snakemake (bioconda)(>=5.4.3*1）
conda install -c bioconda -y snakemake
#flyeを使うならflyeを挿入
conda install -c bioconda -y flye
#またはcanuアセンブラ
conda install -c conda-forge -c bioconda Canu=1.8
git clone https://github.com/elimoss/lathe.git
cd lathe/
git pull
ONTのHPから guppyをダウンロード、パスを通す。
実行方法
configdファイルを準備する。
> cat lathe/config.yaml
$ cat config.yaml
sample_name: 'sample'
#data input
fast5_directory: '/absolute/path/to/fast5/data/' #no relative paths!
flowcell: 'FLO-MIN106'
kit: 'SQK-LSK109'
#workflow steps to perform
assembler: 'flye' #or canu
min_contig_size: 0 #remove contigs smaller than this from the assembly (can speed up polishing but potentially hurt genome completeness)
skip_circularization: False
skip_polishing: False
polish_both: False #should the input to short read polishing be the output of long read polishing?
short_reads: '' #Comma-separated forward and reverse optionally gzipped fastq files. Optional. If no reads are given, the pilon step is skipped.
#the below options are all related to Canu. genome_size is used by Flye as well.
canu_args: 'cnsThreads=2 cnsMemory=32'
usegrid: True #should Canu use the grid?
grid_options: '--time=80:00:00 --account asbhatt'
genome_size: '100m,250m' #Estimated genome size. The default values work well for typical healthy human gut samples.
#A single value can be specified instead, which will perform only one assembly and bypass
#merging. This would be suitable for bacterial isolate data, small datasets or very simple
#metagenomes.
最低限、fast5のパス、推定ゲノムサイズは修正する。任意でアセンブラの種類（defaultはflye）、 使用スレッドやメモリ使用量上限なども修正する。
実行方法
configファイルを指定する。/dataにconfigファイルがあり、fast5は/data/fast5にあるなら
cd /data
snakemake --use-singularity --singularity-args '--bind /data/,/scg/,/home/ ' -s Snakefile \
--configfile config.yaml --restart-times 0 --keep-going --latency-wait 30
*1
ubuntu18.04にて、１から環境を構築する。goとsingularityの導入(1-2)、snkaemakeの導入(3)、lathe のレポジトリのclone(4)の順に進める。
#ubuntu18.04で実行。既にcondaコマンドが使えるものとする
#1 依存の導入
apt-get update && \
sudo apt-get install -y build-essential \
sudo libssl-dev uuid-dev libseccomp-dev \
sudo pkg-config squashfs-tools cryptsetup
#2 GOの導入
export VERSION=1.13.7 OS=linux ARCH=amd64
wget -O /tmp/go${VERSION}.${OS}-${ARCH}.tar.gz https://dl.google.com/go/go${VERSION}.${OS}-${ARCH}.tar.gz && \
tar -C /usr/local -xzf /tmp/go${VERSION}.${OS}-${ARCH}.tar.gz
##pathを通す
echo 'export GOPATH=${HOME}/go' >> ~/.bashrc && \
echo 'export PATH=/usr/local/go/bin:${PATH}:${GOPATH}/bin' >> ~/.bashrc && \
source ~/.bashrc
#3 singularityのビルド
mkdir -p ${GOPATH}/src/github.com/sylabs && \
cd ${GOPATH}/src/github.com/sylabs && \
git clone https://github.com/sylabs/singularity.git && \
cd singularity git checkout v3.5.3 ./mconfig && \
cd ./builddir && \
make -j && \
sudo make install
#4 snakemakeの導入
conda create -n snakemake -y
conda activate snakemake
conda install -c bioconda -c conda-forge -y snakemake==3.5.4
手順はsingularityの導入マニュアルに準拠している。1-4に加えて、flye/canu、guppyを使えるようにしておく。
https://hub.docker.com/r/snakemake/snakemake/tags
まだベータ版だが、macでもSINGULARITY DESKTOP MACOS（https://sylabs.io/singularity-desktop-macos/）をインストールすればsingularityを利用できる。 自己解凍の.dmgに従うだけで２−３分でインストール可能。インストール後、４を実行する。
引用
Complete, closed bacterial genomes from microbiomes using nanopore sequencing
Eli L. Moss, Dylan G. Maghini & Ami S. Bhatt
Nature Biotechnology (2020)
参考
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