2019 2/19 インストールの流れを修正
2021 8/11 condaインストール追記, help更新
見つけたいIS配列や抗生物質耐性カセット配列をあらかじめ入力することで、ペアエンド情報を使いISの位置を検出してくれるツール。バクテリア用に設計されており、macbook airなどのlaptopでも高速に動作する。トランスポゾンやマーカー遺伝子でタギングした系の位置の検出にも力を発揮する。論文では予測結果をPCRで確認しており、false callが非常に少ないことも主張されている。
原理
BWA-MEMを用いて、ペアエンドのイルミナリードをISクエリ配列にマッピングする 。得られたアラインメントファイル（SAM形式）から、SAMtools view（v0.1.19以降）を用いて、ISクエリ配列の末端にペアがマッピングされていないリード（すなわち、ISの直下に位置する配列を表すリード）を抽出し、SAMフラグに基づいてリードを検索する。具体的には、フラグ「-f 36」を用いて左フランキングリード（入力配列を左から右とする）を、フラグ「-F 40 -f 4」を用いて右フランキングリードを抽出し、別々のBAMファイルに格納した後、BedToolsを用いてFASTQ形式に変換する。Samblaster (v0.1.21) [30] を用いて、SAMファイルから、ISの末端にマッピングされ、隣接する配列にまで及んでいるリード（すなわち「ソフトクリップ」リード、図1b）を抽出する。結果として得られたFASTQファイルを、BioPythonを用いてフィルターをかけ、指定したサイズ範囲（デフォルトでは5～30bp）に収まるリードのうち、ソフトクリップされた部分を抽出する。得られた配列を左右のフランキング配列に分け、それぞれをBWA-MEMを用いて参照ゲノムまたはアセンブリにマッピングすることで、解析対象のゲノムにおけるクエリISの位置を特定する。
インストール
依存
- Python v2.7.5
- BioPython v1.63
- BWA v0.7.5a
- Samtools v0.1.19
- Bedtools v2.20.1 -
- BLAST+ v2.2.28
依存ツールはバージョンアップしているが、最新バージョンでも問題なく動作するようである。全てpipとbrewでインストール可（例: brew install samtools & pip install pysam）。
本体 Github
git clone https://github.com/jhawkey/IS_mapper/
pip install IS_mapper/
#conda
mamba install -c bioconda ismapper -y
> ismap --version
$ ismap --version
ismap 2.0
> ismap -h
$ ismap -h
usage: ismap [--version] --reads READS [READS ...] --queries QUERIES
[QUERIES ...] --reference REFERENCE [REFERENCE ...]
[--output_dir OUTPUT_DIR] [--log LOG] [--help_all HELP_ALL]
Basic ISMapper options:
--version show program's version number and exit
--reads READS [READS ...]
Paired end reads for analysing (can be gzipped)
--queries QUERIES [QUERIES ...]
Multifasta file for query gene(s) (eg: insertion
sequence) that will be mapped to.
--reference REFERENCE [REFERENCE ...]
Reference genome for typing against in genbank format
--output_dir OUTPUT_DIR
Location for all output files (default is current
directory).
--log LOG Prefix for log file. If not supplied, prefix will be
current date and time.
--help_all HELP_ALL Display extended help
> compiled_table.py -h
$ compiled_table.py -h
usage: compiled_table.py [-h] --tables TABLES [TABLES ...] --reference
REFERENCE --query QUERY [--gap GAP] [--cds CDS]
[--trna TRNA] [--rrna RRNA] [--imprecise IMPRECISE]
[--unconfident UNCONFIDENT] --out_prefix OUT_PREFIX
Create a table of IS hits in all isolates for ISMapper
optional arguments:
-h, --help show this help message and exit
--tables TABLES [TABLES ...]
tables to compile
--reference REFERENCE
gbk file of reference
--query QUERY fasta file for insertion sequence query for
compilation
--gap GAP distance between regions to call overlapping, default
is 0
--cds CDS qualifier containing gene information (default
product). Also note that all CDS features MUST have a
locus_tag
--trna TRNA qualifier containing gene information (default
product). Also note that all tRNA features MUST have a
locus_tag
--rrna RRNA qualifier containing gene information (default
product). Also note that all rRNA features MUST have a
locus_tag
--imprecise IMPRECISE
Binary value for imprecise (*) hit (can be 1, 0 or
0.5), default is 1
--unconfident UNCONFIDENT
Binary value for questionable (?) hit (can be 1, 0 or
0.5), default is 0
--out_prefix OUT_PREFIX
Prefix for output file
テストラン
オーサーらが準備したテストデータをダウンロードする。
wget ftp://ftp.sra.ebi.ac.uk/vol1/fastq/ERR225/ERR225612/ERR225612_*.fastq.gz
Githubにテストデータのリファレンス (S_suis_P17.gbk) とIS配列 (ISSsu3.fasta) もアップされている。それもダウンロードする。
中身を確認する。
$ cat ISSsu3.fasta
>ISSsu3
TAGTTAAATGAAACAAAAACAGTACATTTATGATATAATGTATTTATGGCATATTCATTA
GATTTTCGTAAAAAAGTTCTCGCATACTGTGAGAAAACCGGCCGTATTACTGAAGCATCA
GCTATTTTCCAAGTTTCACGTAACACTATCTATCAATGGCTAAAATTAAAAGAGAAAACC
GGCGAGCTTCATCACCAAGTTAAAGGAACCAAGCCAAGAAAAGTGGATAGAGATAAATTA
AAGAATTATCTTGAAACTCATCCAGATGCTTATTTGACTGAAATAGCTTCTGAATTTGAC
TGTCATCCAACAGCTATTCATTACGCCCTCAAAGCTATGGGATATACTCGAAAAAAAAGA
GCTGTACCTACTATGAACAAGACCCTGAAAAAGTAGAACTGTTCCTTAAAGAATTGAATA
ACTTAAGCCACTTGACTCCTGTTTATATTGACGAGACAGGGTTTGAGACATGTTTTCATC
GAGAATATGGTCGCTCTTTGAAAGGTCAGTTGATAAAAGGTAAGGTCTCTGGAAGAAGAT
ACCAGCGGATATCTTTAGTGGCAGGTCTCATAAATGGTGCGCTTATAGCCCCGATGACAT
ACAAAGATACTATGACGAGTGGCTTTTTCGAAGCTTGGTTCAAAATATTCTTACTACCCA
CTTTAGGTAAACCATCTGTTATCATCATGGACAATGCAAAGTTTCATAGGATGAGTAAGC
TAAAAGATTTATGCGAGGAGCAGGGACATAGACTTTTACCACTTCCTCCTTACTCACCGG
AATATAATCCCATTGAGAAAATATGGGCTCACATCAAAAAACACCTCAGAAGAGTATTGC
CAAATTGCGATACTTTTCTTGAGGCACTTTCGTCCTGCTCTTGTTTCAGTTGACTA
$ head -40 S_suis_P17.gbk
LOCUS AM946016 2007491 bp DNA circular BCT 14-JUL-2009
DEFINITION Streptococcus suis P1/7 complete genome.
ACCESSION AM946016
VERSION AM946016.1 GI:251819067
DBLINK BioProject: PRJNA352
KEYWORDS complete genome.
SOURCE Streptococcus suis P1/7
ORGANISM Streptococcus suis P1/7
Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Lactobacillales; Streptococcaceae;
Streptococcus.
REFERENCE 1
AUTHORS Holden,M.T., Hauser,H., Sanders,M., Ngo,T.H., Cherevach,I.,
Cronin,A., Goodhead,I., Mungall,K., Quail,M.A., Price,C.,
Rabbinowitsch,E., Sharp,S., Croucher,N.J., Chieu,T.B., Mai,N.T.,
Diep,T.S., Chinh,N.T., Kehoe,M., Leigh,J.A., Ward,P.N.,
Dowson,C.G., Whatmore,A.M., Chanter,N., Iversen,P., Gottschalk,M.,
Slater,J.D., Smith,H.E., Spratt,B.G., Xu,J., Ye,C., Bentley,S.,
Barrell,B.G., Schultsz,C., Maskell,D.J. and Parkhill,J.
TITLE Rapid evolution of virulence and drug resistance in the emerging
zoonotic pathogen Streptococcus suis
JOURNAL PLoS ONE 4 (7), E6072 (2009)
PUBMED 19603075
REMARK Publication Status: Online-Only
REFERENCE 2 (bases 1 to 2007491)
AUTHORS Holden,M.T.G.
TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (10-MAR-2008) Holden M.T.G., Pathogen Genomics, Sanger
Institute Wellcome Trust, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton,
Cambridge, CB10 1SA, UNITED KINGDOM
FEATURES Location/Qualifiers
source 1..2007491
/organism="Streptococcus suis P1/7"
/mol_type="genomic DNA"
/strain="P1/7"
/db_xref="taxon:218494"
gene 1..1374
/gene="dnaA"
/locus_tag="SSU0001"
/gene_synonym="dnaH"
CDS 1..1374
準備ができたらランする。gzip圧縮にも対応している。".fastq.gz”になっている必要がある。
ismap --reads ERR225612_*.fastq.gz --queries ISSsu3.fasta --reference S_suis_P17.gbk --output_dir outdir
- --reads Paired end reads for analysing (can be gzipped)
- --queries Multifasta file for query gene(s) (eg: insertion sequence) that will be mapped to.
- --reference Reference genome for typing against in genbank format
- --output_dir Location for all output files (default is current directory).
- --log Prefix for log file. If not supplied, prefix will be current date and time.
テストデータの出力
gbkファイルを入力すると、このようにIS挿入位置の遺伝子をコールしてくれる。
- ISのクエリ配列は--readsを何度も書くことで複数入力できる。
- リファレンスはfastaかマルチfasta、またはgenbank形式に対応している。テストデータではgenbank形式のリファレンスを用意している。
- paired-endシーケンスデータはfastqの非圧縮、またはgzip圧縮に対応している。ただし名前はテストのようにペアとわかる構造の名前でなくてはならない。
- アセンブルしたcontigや、それにアノテーションをかけgbkにしたファイルを使ってもよい。
本手法はゲノムにない新規の挿入でも、配列がわかれば挿入位置を拾ってくれる。バクテリアのゲノムだとランニングタイムも数分で快適に使える。トランスタギングしたような株からIS挿入位置を探したいならまずこのツールを試し、それからペアードエンドデータから手動で探す方法と比較してみるとよいと思われる。
* 他の手法と同様に、日本語のフォルダパスの下の方にあると動作しないので気をつける。一度エラーになりました。samtoolsは度々仕様が変わりますが、1.4.1でも動作します。
引用
ISMapper: identifying transposase insertion sites in bacterial genomes from short read sequence data
Elizabeth Hénaff, Luís Zapata, Josep M. CasacubertaEmail author and Stephan Ossowski
BMC Genomics. 2015 Sep 3;16:667.
