2020 9/5 修正
2020 9/7 誤字修正、出力追記、
2023/07/04 論文引用
ハイスループットシーケンシングにより、利用可能な単離株、シングルセル、メタゲノムからの微生物ゲノムの数が増加している。これらのゲノムを解析・比較するためには、高速で包括的なアノテーションパイプラインが必要である。ゲノムアノテーションのためのアプローチはいくつか存在するが、これらのアプローチは通常、解析パイプラインへの組み込みを容易にするように設計されておらず、複数のアノテーションデータベースからの結果を組み合わせることができず、また、ハイスループットモードで代謝再構成の使いやすいサマリーを提供していないのが現状である。ここでは、微生物ゲノムの包括的なアノテーションを行うための完全自動化パイプラインであるMicrobeAnnotatorを紹介する。MicrobeAnnotatorはPythonで実装されており、オープンソースのArtistic Licence 2.0のもと、https://github.com/cruizperez/MicrobeAnnotator から自由に利用できる。
インストール
オーサーの指示通り、condaの仮想環境を作ってテストした（OSはubuntu18.04 LTS）。
依存
Programs:
- Aspera Connect
- KofamScan
- HMMER >= 3.1
- Ruby >= 2.5
- GNU Parallel
- One of:
- Blast >= 2.2
- Diamond >= 0.9
- Sword >= 1.0.4
Python Modules:
- matplotlib
- seaborn >= 0.10.1
- pandas
- argparse
- pathlib
- shutil
- subprocess
- gzip
- biopython
- sqlite3
- urllib
- pywget
#依存の導入
mamba create -n microbeannotator -c conda-forge -c bioconda python=3.7 blast hmmer ruby=2.5.1 parallel diamond sword seaborn biopython pywget -y
mamba activate microbeannotator
#kofamscanも導入するなら
mamba install -c bioconda -y kofamscan
Aspera ConnectとKofamScanも必要。
Aspera Connect
#/home/<user>/.aspera/connect/binに導入される
wget https://download.asperasoft.com/download/sw/connect/3.9.8/ibm-aspera-connect-3.9.8.176272-linux-g2.12-64.tar.gz
tar xvfz ibm-aspera-connect-3.9.8.176272-linux-g2.12-64.tar.gz
bash ibm-aspera-connect-3.9.8.176272-linux-g2.12-64.sh
#さらに必要ならパスも通す。例えば/home/kazu/.aspera/connect/binを.bashrcに書き込むなら
#echo 'export PATH=$PATH:/home/kazu/.aspera/connect/bin' >> ~/.bashrc && source ~/.bashrc
KofamScan（6GB）
mkdir kofamscan
cd kofamscan
wget ftp://ftp.genome.jp/pub/db/kofam/ko_list.gz
wget ftp://ftp.genome.jp/pub/db/kofam/profiles.tar.gz
wget ftp://ftp.genome.jp/pub/tools/kofam_scan/kofam_scan-1.3.0.tar.gz
#Decompress and untar:
gunzip ko_list.gz
tar xvfz profiles.tar.gz
tar xvfz kofamscan-1.3.0.tar.gz
cd kofamscan-1.3.0
cp config-template.yml config.yml
export PATH=$PWD:$PATH
configファイルconfig.ymlの# profile: /path/to/your/profile/db のパス部分を自分のデータベースパスに修正する。 => /home/<user>/kofamscan/profiles/prokaryote
さらにko_list: /path/to/your/kolist/file のパス部分を自分のデータベースパスに修正する。 =>ko_list: /home/<user>/kofamscan/ko_list
自分は/home/kazu/Document/に入れたので以下のように修正した。初期はコメントアウトされているので外す。
上の画像ではhmmsearchとparallelのパスも指定しているが、パスが通っているなら設定不要。
kofamscanをテストする。コマンドはexec_annotationなので
./exec_annotation -h
Usage: exec_annotation [options] <query>
<query> FASTA formatted query sequence file
-o <file> File to output the result [stdout]
-p, --profile <path> Profile HMM database
-k, --ko-list <file> KO information file
--cpu <num> Number of CPU to use [1]
-c, --config <file> Config file
--tmp-dir <dir> Temporary directory [./tmp]
-E, --e-value <e_value> Largest E-value required of the hits
-T, --threshold-scale <scale>
The score thresholds will be multiplied by this value
-f, --format <format> Format of the output [detail]
detail: Detail for each hits (including hits below threshold)
detail-tsv: Tab separeted values for detail format
mapper: KEGG Mapper compatible format
mapper-one-line: Similar to mapper, but all hit KOs are listed in one line
--[no-]report-unannotated Sequence name will be shown even if no KOs are assigned
Default is true when format=mapper or mapper-all,
false when format=detail
--create-alignment Create domain annotation files for each sequence
They will be located in the tmp directory
Incompatible with -r
-r, --reannotate Skip hmmsearch
Incompatible with --create-alignment
--keep-tabular Neither create tabular.txt nor delete K number files
By default, all K number files will be combined into
a tabular.txt and delete them
--keep-output Neither create output.txt nor delete K number files
By default, all K number files will be combined into
a output.txt and delete them
Must be with --create-alignment
-h, --help Show this message and exit
実際にランしてみる。kofamscan-1.3.0/ でkofanscanを実行。profileは/prokaryote.halを指定する。
./exec_annotation -o output --cpu 20 -p ../profiles/prokaryote.hal -k ../ko_list your_genome.fa
config.ymlが設定されているならプロファイル指定は不要。全CPU使用してラン。
exec_annotation -o output your_genome.fa
準備ができた。最後に本体を取ってくる。
git clone https://github.com/cruizperez/MicrobeAnnotator.git
cd MicrobeAnnotator/
> ./MicrobeAnnotator_DB_Builder -h
$ ./MicrobeAnnotator_DB_Builder -h
usage: MicrobeAnnotator_DB_Builder [-h] -d DIRECTORY -m METHOD [-t THREADS]
[--bin_path BIN_PATH] [--step STEP]
[--light]
This script build the search databases required by MicrobeAnnotator
Usage: ./MicrobeAnnotator_DB_Builder -f [output_file folder]
Global mandatory parameters: -f [output_file folder]
Optional Database Parameters: See ./MicrobeAnnotator_DB_Builder -h
optional arguments:
-h, --help show this help message and exit
-d DIRECTORY, --dir DIRECTORY
Directory where database will be created.
-m METHOD, --method METHOD
Search (and db creation) method, one of blast, diamond or sword
-t THREADS, --threads THREADS
Threads to use (when possible). By default 1.
--bin_path BIN_PATH Path to binary folder for selected method. By defaul assumes the program is in path.
--step STEP Step to start with. 1.Download data, 2.Parse annotation data, 3.Building SQLite DB, 4.Build protein DBs. Default 1.
--light Use only KOfamscan and swissprot databases. By default also builds refseq and trembl.
> ./MicrobeAnnotator -h
$ ./MicrobeAnnotator -h
usage: MicrobeAnnotator [-h] [-i INPUT_LIST [INPUT_LIST ...]] [-l FILE_LIST]
-o OUTPUT_DIR -d DATABASE_FOLDER -m METHOD
[--kofam_bin KOFAM_BIN] [--method_bin METHOD_BIN]
[--id_perc ID_PERC] [--bitscore BITSCORE]
[--evalue EVALUE] [--aln_percent ALN_PERCENT]
[--cluster CLUSTER] [--filename PLOT_FILENAME]
[-t THREADS] [-p PROCESSES] [--light] [--full]
MicrobeAnnotator parses protein fasta files and annotates them
using several databases in an iterative fashion and summarizes the findings
using KEGG modules based on KO numbers associated with best database matches.
Usage: ./MicrobeAnnotator -i [protein file] -o [output folder] -d [MicrobeAnnotator db folder]
-m [search method]
Global mandatory parameters: -i [protein file] -o [output folder] -d [MicrobeAnnotator db folder]
-m [search method]
Optional Database Parameters: See ./MicrobeAnnotator -h
optional arguments:
-h, --help show this help message and exit
Mandatory i/o options.:
-i INPUT_LIST [INPUT_LIST ...], --input INPUT_LIST [INPUT_LIST ...]
Space-separated list of protein files to parse. Use -i OR -l.
-l FILE_LIST, --list FILE_LIST
File with list of inputs. Use -i OR -l.
-o OUTPUT_DIR, --outdir OUTPUT_DIR
Directory to store results.
-d DATABASE_FOLDER, --database DATABASE_FOLDER
Directory where MicrobeAnnotator databases are located.
Options for search process.:
-m METHOD, --method METHOD
Method used to create databases and to perform seaches. One of "blast", "diamond" or "sword".
--kofam_bin KOFAM_BIN
Directory where KOFamscan binaries are located. By default assumes it is in PATH.
--method_bin METHOD_BIN
Directory where KOFamscan binaries are located. By default assumes it is in PATH.
--id_perc ID_PERC Minimum identity percentage to retain a hit. By default 40.
--bitscore BITSCORE Minimum bitscore to retain a hit. By default 80.
--evalue EVALUE Maximum evalue to retain a hit. By default 0.01.
--aln_percent ALN_PERCENT
Minimum percentage of query covered by hit alignment. By default 70.
Summary abnd plotting options.:
--cluster CLUSTER
Cluster genomes and/or modules. Select "cols" for genomes, "rows" for modules, or "both".
By default, no clustering
--filename PLOT_FILENAME
Prefix for output summary tables and plots. By default "metabolic_summary"
Miscellaneous options.:
-t THREADS, --threads THREADS
Threads to use per processed file, i.e. (per protein file). By default 1.
-p PROCESSES, --processes PROCESSES
Number of processes to launch, i.e. number of protein files to process simultaneously.
Note this is different from threads. For more information see the README. By default 1.
--light
Use only KOfamscan and swissprot databases. By default also uses refseq and
trembl (only use if you built both using "MicrobeAnnotator_DB_Builder").
--full
Do not perform the iterative annotation but search all proteins against all databases
(Increases computation time).
データベースの準備
databaseをビルドする。フルバージョン（230GBほどスペースが必要）と軽量版がある。軽量版は依存するデータベースが少なくなっている（--lightを立てて実行する）。blast、diamond、swordに対応しているが、ここではdiamondデータベースを作る。ここでは40スレッド使用。
MicrobeAnnotator_DB_Builder -d MicrobeAnnotator_DB -m diamond -t 40 --light
ライトバージョンのデータベース準備完了。フルバージョンも何度か試したが、データベースダウンロード途中で接続が切れた。
実行方法
ゲノムとデータベースを指定する。複数ゲノムある場合はスペースで区切って指定するかワイルドカード指定する。
MicrobeAnnotator -i genome1.fa genome2.fa genome3.fa -d MicrobeAnnotator -o output_dir -m diamond -p 3 -t 10
- -p refers to the number of protein files to be processed simultaneously, e.g -p 3 will process three protein files at the same time.
- -t refers to the number of processors to use per protein file. For example -t 5 will use five processors per each protein file.
- -m [blast, diamond, sword] the search method you intend to use.
hmmsearchのランでエラーになる。
=> 使用したゲノムがヘッダーとDNA配列の２行構成なのが原因だった。適当な文字数で改行したらランできるようになった。
出力 （--ligtht）
output_dir/annotation_results/genome.fasta.annotations
計算に２日も要した。何か空回りするような計算ステップがあるかもしれない。
引用
MicrobeAnnotator: a user-friendly, comprehensive microbial genome annotation pipeline
Carlos A. Ruiz-Perez, Roth E. Conrad, Konstantinos T. Konstantinidis
bioRxiv, Posted July 21, 2020
追記
MicrobeAnnotator: a user-friendly, comprehensive functional annotation pipeline for microbial genomes
Carlos A. Ruiz-Perez, Roth E. Conrad & Konstantinos T. Konstantinidis
BMC Bioinformatics volume 22, Article number: 11 (2021)
