macでインフォマティクス

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NGS関連のインフォマティクス情報についてまとめています。

Microbial mat(微生物マット)からの高品質なgDNA抽出プロトコル

 

 メタゲノムデータの正確で正確な分析と解釈は、高品質で高分子量(HMW)のコミュニティDNAの効率的な抽出にかかっている。しかしながら、environmental mat サンプルはしばしば高濃度の高品質HMW DNAを得ることを困難にする。好塩性微生物マットには、大量の細胞外高分子物質(EPS)と、抽出されたDNAの下流での使用を妨げる可能性のある塩が含まれている。溶けにくい試料からのDNA抽出には直接の苛酷な方法がしばしば使用される。これらの方法は、溶解中に固着性マトリクスの EPSがDNAを結合するため使用される。より厳しい抽出方法の結果として、DNAは小さなサイズに断片化されるようになる(ref.4,5,6)。

 したがって、このような方法で抽出したDNAはラージインサートのベクターへクローニングするには不適切になる。これらの制限を回避するために、著者らは高品質の微生物マットから高品質で大量のHMW DNAを抽出する改良された方法論を報告する。このプロトコルA260/280比で、マットサンプル1グラムあたり約2μgのHMW DNA(35-50 kb)を抽出する。さらに、16S rRNA遺伝子の増幅は、このプロトコールが混入物のあらゆる阻害効果を最小化または排除できることを示唆している。著者らの結果は、機能メタゲノム研究のための微生物マットからのHMW DNAの抽出のための適切な方法論を提供する。本方法は、DNA抽出が困難な他の環境サンプルにも適用できる可能性がある。

 

ビデオジャーナルなので動画(9:30)があります。

論文リンク

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3346306/

 

手順(論文より転載)

f:id:kazumaxneo:20190107195413p:plain

 

1. Microbial Cell Extraction

  1. 滅菌粉砕乳棒で徹底的に混合して微生物マットを均質化する。均質化したマット材料約30g(湿重量)をWaringブレンダーの滅菌容器に入れ、約100mlの1M NaCl(または使用中の試料に特異的な濃度)を加え、-20℃の冷凍庫で中程度の速度で1分間混合し、-20度で1分間冷却する。これを3回繰り返す。スラリーを250mlの遠心分離ボトルに移し、1MのNaClで残りの空の容量を満たす。
  2. さらにボルテックス(Vortex-GenieR 2)を用いて室温で30分間振盪(150rpm)することで、マトリックスから微生物細胞を剥がす。
  3. 4℃で15分間、低速(500×g)で遠心する。沈殿したペレットが入らないように気をつけながら上清を静かにフラスコに移す。
  4. ペレット化した沈殿物を使用して、混合およびステップ1.2、1.3をさらに4回繰り返す。各上清を新しいフラスコに移す。
  5. 細胞抽出からの5回分の上清を使い、4℃で15分間、高速(25,000×g)遠心する。上清を捨て、各細胞ペレットを10mLの2%ヘキサメタリン酸ナトリウムに再懸濁し、ペレットを混合して2%ヘキサメタリン酸ナトリウムで200mLにする。室温で30分間振盪(150 rpm)して細胞を洗浄する。このステップの終わりに、あなたは次のステップに進むために細胞の1本のチューブだけを持つべき。
  6. 4℃で15分間、高速(25,000×g)遠心する。上清を捨て、細胞ペレットを200 mLのTE(50 mM EDTA)に再懸濁し、室温で10分間振盪(150 rpm)して細胞を洗浄する。
  7. 4℃で15分間高速(25,000×g)遠心し、上清を捨て、15 mLのTE(10 mM EDTA)に再懸濁し、DNA抽出に必要になるまで-80℃で200-μLのaliquotsを保存する。

 

2. DNA Extraction and Purification

  1. 200μLの5M NaCl、200μLの10%SDS、および100μLの14.3M β-メルカプトエタノールを200μLの微生物細胞aliquotsに加える。 4〜6回転倒混和する。
  2. 液体窒素に2分間浸した後、65℃の水浴5分間で解凍するfreeze-thaw サイクルを3回繰り返す。最後の解凍は10分に延長する。
  3. 5M 酢酸カリウム(pH5.5)200μLを加え、氷上に10分間置く。 4℃で10分間10,000×gで遠心し、口径の広いチップを用いて上清を新しいチューブに移す。 3µLのRNaseAを添加し、37℃で1時間インキュベートする。
  4. 等量のクロロホルムを加え、ひっくり返して短時間振盪し、15,000 x gで10分間室温で遠心する。
  5. 口径の広いチップを使用して、上清の最上層を新しいチューブに慎重に移す。最上層と最下層の間にある白い界面層をピペッティングしないこと。クロロホルム抽出手順を繰り返す。
  6. 上清に等量の冷却(-20℃)イソプロパノールを加え、氷上で30分間インキュベートしてDNAを沈殿させる。
  7. DNAをペレットにするために4℃で10分間最高速度(20,800×g)で遠心する。
  8. 上清を捨て、DNAペレットを1mLの冷却した(-20℃で)70%エタノールで洗浄する。
  9. 4℃で10分間最高速度(20,800×g)で遠心し、上清を捨て、70%エタノール洗浄を繰り返し、10分間DNAペレットを風乾する。 70%エタノール洗浄を繰り返す。
  10. DNAを25 µLのTE(10 mM EDTA)に再懸濁し、65℃で5分間温め、複数のチューブを使用している場合は1つのチューブにまとめ、TEで500 µLにメスアップする。
  11. 500μLの氷冷(または4℃で)20%ポリエチレングリコール(PEG)(1.2M NaClで調製)を加える。転倒混和して静かに混合し、氷上で10分間インキュベートした後、4℃で10分間最高速度で遠心してDNAをペレットにする。上清を取り除き、ペレット化したDNAを1 mLの冷却した70%エタノールで洗浄し、10分間風乾した後、30〜50 µLのTEまたはmolecularグレードの水に再懸濁する。 65℃で5分間加温してDNAの再懸濁を促進し、-80℃でDNAを保存する。

 

3. DNA Purity, Concentration and Size Determination

  1. Nanodrop 1000分光光度計または他の適切な機器を使用してA260 / 280およびA260 / 230の比率を測定して、DNAの品質を決定する。
  2. 製造元の指示に従って、Quant-iT dsDNA Assayキットを使用してDNA濃度を決定する。
  3. パルスフィールドゲル電気泳動を使用してDNAサイズを決定する。(パラメータ省略。は論文を確認して下さい)泳動後のゲルを1×SYBR Green Iで30分間染色する。

 

結果

Cell extraction
 連続的な微生物細胞抽出では、抽出数が増加するにつれて抽出物の濁度が減少することを示した。これは、繰り返しの細胞抽出による細胞数の減少を示唆している。ここで注意することは、各追加の細胞抽出工程が汚染物質導入の機会を提供するので、最終細胞ペレットが全体の微生物群集を代表するように細胞抽出の数を最小限にするべきであるということである。他の汚染源は適切な実験室用滅菌技術を採用することによって管理された。例えば、溶液をオートクレーブ処理したDI水中で調製して濾過滅菌した。容器をアルコールで滅菌し、オートクレーブ処理し、そしてUVおよびultraviolet crosslinkerで処理した。

DNA concentration and quality determination
 このプロトコルにより、マットサンプル1グラム当たり、A260/280比が1.6、A260/230比が0.7(表1)、約2µgのHMW DNA(35〜50kb)(図4)が得られた。A260/230の比率は低いように見えるが、別の研究では16S rRNA遺伝子のPCR増幅などのアプリケーションでの阻害は観察されなかった(ref.7)。好塩性微生物マットからのDNAには、EPSと塩という2つのメジャーな汚染源があることに注意することが重要になる。 したがって、これらの汚染物質が、多大な努力にもかかわらず残存し、A260/280比に影響を与えている可能性がある。

DNA size determination

パルスフィールドゲル電気泳動から、本プロトコルは、約35〜50kbのHMW DNAを生じた。 いくらかのDNAサイズは30kbより小さくてもよいが、フォスミドクローニングは約40kbのDNA insertを必要とする。大きなDNAフラグメントは無傷の生合成経路へのより大きなアクセスを提供するので、DNAの一部は35kb以上あることが重要である。 

 

 複雑で非常に多様な微生物マットサンプルからの全細胞取り出しが実用的ではないことを考えると、主な関心事は抽出された細胞が微生物マットコミュニティ全体をどの程度うまく表しているかである。以前の研究では、微生物の16S rRNA遺伝子のPCR-DGGE分析は、このプロトコルで使用されている5つの細胞除去ステップが全体の微生物マット群集の代表である細胞を抽出することを示した(ref.7)。微生物群集を代表する細胞ペレットを提供するのに必要とされる細胞抽出工程の実際の数は、試料の種類に応じて変わる可能性が高い。異なるサンプルの最適なプロトコル開発のために、小規模の予備的研究が推奨される。(以下略)

 

 

引用
Extraction of High Molecular Weight DNA from Microbial Mats
Benjamin S. Bey, Erin B. Fichot, R. Sean Norman

J Vis Exp. 2011; (53): 2887. Published online 2011 Jul 7