2020 5/24 レポジトリが引っ越ししているので、リンク更新
2022/09/06 インストール手順更新
高分解能の微生物菌株同定およびトレースは、臨床および研究環境の両方において重要な課題である。微生物の菌株レベルのタイピングのための最も一般的な方法の1つは、すべての株に存在することが知られている少数の種特異的ゲノム遺伝子座（通常は7つ）をシーケンシングすることに基づくmultilocus sequence typing（MLST）を与えられた標的種全てで行うことである。そのシンプルさと解像度のおかげで、多くの原核生物（ref.2,3）および真核微生物（ref.4）にMLSTアプローチが定義され採用されてきた。様々な 病原菌種に対応した何千ものMLSTのプロファイルとシーケンスのデータベースが利用可能になっている（ref.5,6）。
臨床でのMLSTの日常的な使用を妨げる制限要因は、関心のある各細菌種を単離して培養する必要性である。 MLSTプロトコル（標的遺伝子座のDNA抽出、PCR増幅、精製およびシーケンシング）も高価で面倒である。次世代シークエンシング技術のスループット向上によるコスト削減により、サンプル（metagenomics（ref.7））の全DNA含量を直接シーケンシングして、時間のかかる単離および培養をスキップして複雑な微生物群集の特性評価を行う効果的なアプローチが可能になっている。メタゲノムデータセットは、所与の微生物群集に存在するすべての菌株のシーケンス情報を含み、理論的には、サンプル中のすべての種のデータをタイピングすることができる。
メタゲノムMLSTタイピングを達成するための可能な戦略は、メタゲノミクスアセンブリを行い、そのメタゲノミクスコンティグをMLSTデータベースに対してマッピングすることである。しかしながら、このアプローチは、豊富な株（すなわちアセンブリのための十分なデプスを有する株）しか明らかにならない。さらに、メタゲノミクスアセンブリは計算上要求が厳しい。したがって、現在、メタゲノムからMLST遺伝子座を容易かつ効率的に抽出する方法はない。
MLST手法の有効性と、培養フリーかつ高処理能力のメタゲノミクスを組み合わせるために、著者らはMetaMLSTと呼ばれる微生物タイピングのための新しい計算パイプラインを開発した。利用可能なMLST lociを持つ種について、MLST lociのテンプレートデータベースが与えられると、MetaMLSTは、メタゲノミクス試料中の微生物株のlociプロファイルのin silicoコンセンサス配列再構築を行う。再構成されたloci（プロファイル）は、PubMLST（ref.5）で維持されている公に利用可能なプロファイルのデータベースと比較することによって同定される。新しいalleles、すなわちデータベースに存在しない新しいallelesは、配列内部データベースをテンプレートとして使用し、与えられた信頼スコアに基づき、comparative sequence reconstruction によって決定される。このマッピングベースの手法は、計算上の制限を克服し、メタゲノムアセンブリと比較して検出限界を減らすことできる。下流の標準MLSTパイプラインに続いて、サンプルを個別に処理してsequence types（ST）プロファイルを決定し、疫学分析のために組み合わせ、可能であれば公的データベースで利用可能な多数のプロファイリングされた株と統合する。このソフトウェアは、http://segatalab.cibio.unitn.it/tools/metamlst/のサポート資料で自由に入手できる。
HP
Segata Lab - Computational Metagenomics
https://bitbucket.org/CibioCM/metamlst/wiki/Home
Segata Lab のツールは以前も何度か紹介させてもらっています。
MetaMLST works by reconstructing the MLST loci-sequences using the closest reference from the publicly available datsets (PubMLST) and traces the most abundant strain of each species. Bitbucketより。
インストール
mac os10.13のanaconda3-5.0.0環境でテストした。
依存
Bitbucket Github
git clone https://github.com/SegataLab/metamlst.git
cd metamlst/
> python3 metamlst.py
$ python3 metamlst.py
usage: metamlst.py [-h] [-o OUTPUT FOLDER] [-d DB PATH]
[--filter species1,species2...] [--penalty PENALTY]
[--minscore MINSCORE] [--max_xM XM] [--min_read_len LENGTH]
[--min_accuracy CONFIDENCE] [--debug] [--presorted]
[--quiet] [--version] [--nloci NLOCI] [--log] [-a]
[BAMFILE]
Reconstruct the MLST loci from a BAMFILE aligned to the reference MLST loci
positional arguments:
BAMFILE BowTie2 BAM file containing the alignments (default:
None)
optional arguments:
-h, --help show this help message and exit
-o OUTPUT FOLDER Output Folder (default: ./out) (default: ./out)
-d DB PATH, --database DB PATH
Specify a different MetaMLST-Database. If unset, use
the default Database. You can create a custom DB with
metaMLST-index.py) (default: /Users/kamisakakazuma/loc
al/metamlst/metamlst_databases/metamlstDB_2018.db)
--filter species1,species2...
Filter for specific set of organisms only (METAMLST-
KEYs, comma separated. Use metaMLST-index.py
--listspecies to get MLST keys) (default: None)
--penalty PENALTY MetaMLST penaty for under-represented alleles
(default: 100)
--minscore MINSCORE Minimum alignment score for each alignment to be
considered valid (default: 80)
--max_xM XM Maximum SNPs rate for each alignment to be considered
valid (BowTie2s XM value) (default: 5)
--min_read_len LENGTH
Minimum BowTie2 alignment length (default: 50)
--min_accuracy CONFIDENCE
Minimum threshold on Confidence score (percentage) to
pass the reconstruction step (default: 0.9)
--debug Debug Mode (default: False)
--presorted The input BAM file is sorted and indexed with
samtools. If set, MetaMLST skips this step (default:
False)
--quiet Suppress text output (default: False)
--version Prints version informations (default: False)
--nloci NLOCI Do not discard samples where at least NLOCI (percent)
are detected. This can lead to imperfect MLST typing
(default: 100)
--log generate logfiles (default: False)
-a Write known sequences (default: False)
>python3 metamlst-merge.py -h
$ python3 metamlst-merge.py -h
usage: metamlst-merge.py [-h] [-d DB PATH] [--filter species1,species2...]
[-z ED] [--meta METADATA_PATH] [--idField IDFIELD]
[--outseqformat {A,A+,B,B+,C,C+}]
[-j subjectID,diet,age...] [--jgroup] [--version]
[folder]
Detects the MLST profiles from a collection of intermediate files from MetaMLST.py
positional arguments:
folder Path to the folder containing .nfo MetaMLST.py files
optional arguments:
-h, --help show this help message and exit
-d DB PATH, --database DB PATH
Specify a different MetaMLST-Database. If unset, use the default Database. You can create a custom DB with metaMLST-index.py)
--filter species1,species2...
Filter for specific set of organisms only (METAMLST-KEYs, comma separated. Use metaMLST-index.py --listspecies to get MLST keys)
-z ED Maximum Edit Distance from the closest reference to call a new MLST allele. Default: 5
--meta METADATA_PATH Metadata file (CSV)
--idField IDFIELD Field number pointing to the 'sampleID' value in the metadata file
--outseqformat {A,A+,B,B+,C,C+}
A : Concatenated Fasta (Only Detected STs)
A+ : Concatenated Fasta (All STs)
B : Single loci (Only New Loci)
B+ : Single loci (All loci)
-j subjectID,diet,age...
Embed a LIST of metadata in the the output sequences (A or A+ outseqformat modes). Requires a comma separated list of field names from the metadata file specified with --meta
--jgroup Group the output sequences (A or A+ outseqformat modes) by ST, rather than by sample. Requires -j
--version Prints version informations
実行方法
１、データベースの準備
初回のみデータベースのダウンロードとビルドを行う必要がある。データベースが見つからなければラン時に再構築される。
#オーサーが準備した2018更新データがダウンロードされる。
python3 metamlst-index.py
#indexing
python3 metamlst-index.py -i bowtie_index
または下記からダウンロードする。
https://bitbucket.org/CibioCM/metamlst/downloads/
a$ metamlst-index.py -i bowtie_index
-bash: metamlst-index.py: command not found
kamisakBookpuro:metamlst kamisakakazuma$ python3 metamlst-index.py -i bowtie_index
Database /Users/kamisakakazuma/local/metamlst/metamlst_databases/metamlstDB_2018.db contains:
133 organisms
923 total loci
115566 total alleles (~54.71 Megabases)
13928 total profiles
COLLECTING DATA... [ - ... - ]
BUILDING INDEX [ - ... - ]
BUILDING INDEX [ - DONE - ]
完了。以後は作成した"bowtie_index"を使う。
２、データベースへのマッピング
example/4_single_sample_multiple_species/の２サンプルを使う。
#サンプル1
bowtie2 --threads 4 --very-sensitive-local -a --no-unal -x bowtie_index \
metamlst_examples/4_two_samples_with_metadata/SRS015937_epidermidis.fastq \
| samtools view -bS - > SRS015937_epidermidis.bam
#サンプル2
bowtie2 --threads 4 --very-sensitive-local -a --no-unal -x bowtie_index \
metamlst_examples/4_two_samples_with_metadata/SRS013261_epidermidis.fastq \
| samtools view -bS - > SRS013261_epidermidis.bam
ペアエンドは-1と-2フラグを立てて指定する。並列処理数は--threadsで指定する。bamが出力される。
３、データベースへのアライメント結果からベストマッチの配列を決め、MLST alleleを再構成する
#1
metamlst.py SRS015937_epidermidis.bam -o ./out/
#2
metamlst.py SRS013261_epidermidis.bam -o ./out/
$ python3 metamlst.py SRS013261_epidermidis.bam -o ./out/
--------------------------- SRS013261_epidermidis ----------------------------
sepidermidis Detected Loci: arcC, aroE, gtr, mutS, pyrR, tpiA, yqiL
Closest allele identification [ - ... - ]
Locus Avg. Coverage Score Hits Reference Allele(s)
arcC 33.51 183.3 2990 8
aroE 24.02 179.0 1656 7
gtr 26.63 177.9 1863 12
mutS 31.48 178.2 1613 4
pyrR 25.38 183.8 1607 12
tpiA 28.89 180.1 1637 2
yqiL 34.91 172.2 2531 2
Building Consensus Sequences [ - ... - ]
Locus Ref. Length Ns SNPs Confidence Notes
arcC 8 465 0 0 100.0 % --
aroE 7 420 0 0 100.0 % --
gtr 12 438 0 0 100.0 % --
mutS 4 412 0 0 100.0 % --
pyrR 12 428 0 0 100.0 % --
tpiA 2 424 0 0 100.0 % --
yqiL 2 416 0 0 100.0 % --
Reconstruction Successful [ - WRITE - ]
pacnes Detected Loci: CAMP2, aroE, atpD, gmk, guaA, lepA, sodA, tly
Closest allele identification [ - ... - ]
Locus Avg. Coverage Score Hits Reference Allele(s)
CAMP2 101.19 184.6 864 6
aroE 25.29 176.8 106 1
atpD 28.22 174.0 129 1
gmk 17.56 175.1 71 1
guaA 26.13 179.4 130 3
lepA 46.12 187.6 226 1
sodA 30.4 177.7 138 1
tly 36.64 184.3 297 8
Building Consensus Sequences [ - ... - ]
Locus Ref. Length Ns SNPs Confidence Notes
CAMP2 6 804 0 0 100.0 % --
aroE 1 424 0 0 100.0 % --
atpD 1 453 0 0 100.0 % --
gmk 1 400 0 0 100.0 % --
guaA 3 493 0 0 100.0 % --
lepA 1 452 0 0 100.0 % --
sodA 1 450 0 0 100.0 % --
tly 8 777 0 0 100.0 % --
Reconstruction Successful [ - WRITE - ]
saureus Detected Loci: tpi, yqiL
Missing Loci : arcC, aroE, glpF, gmk, pta
szooepidemicus Detected Loci: tpi
Missing Loci : arcC, nrdE, proS, spi, tdk, yqiL
sbsec Detected Loci: tpi
Missing Loci : ddl, gki, glnA, mutS, mutS2, pheS, proS, pyrE, thrS
kpneumoniae Detected Loci: pgi
Missing Loci : gapA, infB, mdh, phoE, rpoB, tonB
koxytoca Detected Loci: pgi
Missing Loci : gapA, infB, mdh, phoE, rpoB, tonB
mabscessus Detected Loci: Mab-rpoB
Missing Loci : Mab-argH, Mab-cya, Mab-gnd, Mab-murC, Mab-pta, Mab-purH
cdiphtheriae Detected Loci: atpA, rpoB
Missing Loci : dnaE, dnaK, fusA, leuA, odhA
pfluorescens Detected Loci: rpoB
Missing Loci : glnS, gyrB, ileS, nuoD, recA, rpoD
streptomyces Detected Loci: atpD
Missing Loci : 16S, gyrB, recA, rpoB, trpB
soralis Detected Loci: ddl
Missing Loci : aroE, gdh, gki, hexB, recP, xpt
spneumoniae Detected Loci: ddl, gki
Missing Loci : aroE, gdh, recP, spi, xpt
bcc Detected Loci: lepA
Missing Loci : atpD, gltB, gyrB, phaC, recA, trpB
mcaseolyticus Detected Loci: tuf
Missing Loci : ack, cpn60, fdh, pta, purA, sar
arcobacter Detected Loci: aspA
Missing Loci : atpA, glnA, gltA, glyA, pgm, tkt
ecoli Detected Loci: adk, fumC
Missing Loci : gyrB, icd, mdh, purA, recA
mcanis Detected Loci: tuf
Missing Loci : ack, cpn60, fdh, pta, purA, sar
aeromonas Detected Loci: groL
Missing Loci : gltA, gyrB, metG, ppsA, recA
neisseria Detected Loci: fumC
Missing Loci : abcZ, adk, aroE, gdh, pdhC, pgm
smaltophilia Detected Loci: recA
Missing Loci : atpD, gapA, guaA, mutM, nuoD, ppsA
tenacibaculum Detected Loci: atpA
Missing Loci : dnaK, glyA, gyrB, infB, rlmN, tgt
clari Detected Loci: Cla-atpA
Missing Loci : Cla-adk, Cla-glnA, Cla-glyA, Cla-pgi, Cla-pgm, Cla-tkt
bpseudomallei Detected Loci: gltB
Missing Loci : ace, gmhD, lepA, lipA, narK, ndh
efaecalis Detected Loci: gyd
Missing Loci : aroE, gdh, gki, pstS, xpt, yqiL
efaecium Detected Loci: gyd
Missing Loci : adk, atpA, ddl, gdh, pstS, purK
senterica Detected Loci: purE
Missing Loci : aroC, dnaN, hemD, hisD, sucA, thrA
spseudintermedius Detected Loci: tuf
Missing Loci : ack, cpn60, fdh, pta, purA, sar
[ - Completed - ]
検出されたlociとmissingのlociがそれぞれ表示される。
４、複数サンプルの解析では、次のステップにメタデータファイルを読み込む必要があるので、ここで準備する。ここでは公式に習いsample_metadata.txtといファイル名にした。書式はexample5のメタデータファイルを真似した。
sampleID metadata_field_1 dataset_name source
SRS013261 some_data1 hmp source1
SRS015937 some_data1 hmp source1
５、strain typing
metamlst-merge.py --meta sample_metadata.txt ./out/
$ metamlst-merge.py ./out/
+------------------------------------------------------------------------------+
| Staphylococcus epidermidis |
+------------------------------------------------------------------------------+
KNOWN MLST profiles found:
ST arcC aroE gtr mutS pyrR tpiA yqiL Hits
19 8 7 12 4 12 2 2 1
NEW MLST profiles found:
ST arcC aroE gtr mutS pyrR tpiA yqiL Hits
100001 1 1 1 2 2 1 13 1
REJECTED NEW MLST profiles, as they have > SNPs than max-threshold (-z 5)
ST arcC aroE gtr mutS pyrR tpiA yqiL Hits
Outputing results [ - ... - ]
+------------------------------------------------------------------------------+
| Propionibacterium acnes |
+------------------------------------------------------------------------------+
KNOWN MLST profiles found:
ST CAMP2 aroE atpD gmk guaA lepA sodA tly Hits
4 6 1 1 1 3 1 1 8 1
NEW MLST profiles found:
ST CAMP2 aroE atpD gmk guaA lepA sodA tly Hits
REJECTED NEW MLST profiles, as they have > SNPs than max-threshold (-z 5)
ST CAMP2 aroE atpD gmk guaA lepA sodA tly Hits
Outputing results [ - ... - ]
Colour Legend:
--------------------------------------------------------------------------------
Alleles: [Known] [NEW] [NEW-RECURRING]
Profiles: [Known] [NEW] [NEW*]
New* profiles are composed by Known and Recurring alleles only
--------------------------------------------------------------------------------
Completed! Have a nice day.
解説: Githubより
MetaMLST Report File: Contains the aggregate analysis for all the samples.
MetaMLST ST File : Contains the new S. epidermidis ST table after the analys (all the known profiles plus the new profiles detected in the samples).
ツールにPATHが通っていれば、他のexampleもそれぞれのサブディレクトリのtest.shを叩くことで実行できます。wikiの他のexampleには、MetaMLSTで解析後、タイピング結果を元に系統樹やMinimum Spanning Trees （wiki）を描く流れにも簡単に触れられています。
感想
メタゲノムアセンブリのbinningツールは、データによってはspeciesレベルのbinningを可能にしますが、ultra deep シーケンシングしてもstrainレベルの分類はまだ困難なままです（論文 Fig.2d Critical Assessment of Metagenome Interpretation—a benchmark of metagenomics software）。これは、メタゲノムのショートリードシーケンシングデータからde novoアセンブリを行っても、よく似たゲノムはまとめられてしまうためです。研究の目的によっては、MLSTのようなstrainレベルの分解能を持った手法も引き続き重要になってきます。
引用
MetaMLST: multi-locus strain-level bacterial typing from metagenomic samples
Zolfo M, Tett A, Jousson O, Donati C, Segata N
Nucleic Acids Res. 2017 Jan 25;45(2):e7
