illumina-utilsはpythonで記述されたilluminaのシーケンスデータのユーティリティツール。オーバーラップしたペアリードのmergeやクオリティフィルタリングを行うことができる。
インストール
sudo pip install illumina-utils
実行方法
raw fastqのdemulitiplexing。
ランにはindexの情報が載ったテキストファイルが必要。フォーマットについては公式の例を参照。
iu-demultiplex -s barcode_to_sample.txt --r1 r1.fastq --r2 r2.fastq --index index.fastq -o output/
illuminaの提供しているdemulitiplexツールはbcl2fastq（リンク）。
ほとんどのコマンドのランにはコンフィグファイルが必要。以下のようなファイル（input.txt）を元にコンフィグファイルを作成することができる。
sample r1 r2
e_coli ecoli-R1.fastq ecoli-R2.fastqコンフィグファイルの作成。
iu-gen-configs input.txt
この例だとe_coli.iniができる。中身を確認する。
user$ cat e_coli.ini
[general]
project_name = e_coli
researcher_email = u@example.edu
input_directory = /Users/user/Documents/test/
output_directory = /Users/use/Documents/test/
[files]
pair_1 = ecoli-R1.fastq
pair_2 = ecoli-R2.fastq
オーバーラップがあるペアリードのマージ。先ほどのconfigファイルを指定する。
iu-merge-pairs e_coli.ini
ランにはそれなりの時間がかかる（macbook pro corei7モデルだと300-bpの200万x2リードの処理1時間以上）。マージが終わると、マージが成功した配列と失敗した配列が別々のファイルで出力される。また、レポートも出力される。
マージされたfastqは、ヘッダーにどのような状態でマージされたかを示す情報がつく。クオリティ行は削られfastaフォーマットになっている。
user$ head -4 e_coli_MERGED
>e_coli_19|M02077:18:000000000-A88N7:1:1101:14587:1648 1:N:0:1|o:229|m/o:0.013100|MR:n=0;r1=3;r2=0|Q30:n/a|CO:0|mismatches:3
aattaaaaaaacttggctggcaatatgttcctggctgtttggaagatcaacctgttcctactgatccactgaTtactgaacgggaaagttttaagcagattcttattaagccccgacttcagcaagcCcttaagcgCattaatctgactgatgatggagagccatggctagatgactaccaaattgagtcggccatttcccagctagagcgggctgtcaccaccgaaaagctgatcgaagccaatcaactcatcacagaactgctctggaatggtgtgactgtattcgttcccaatggtaaagatgaaattgttcagttcattgatttcgagaatattgagcagaatgatttccttgccatcaatcaatatg
>e_coli_28|M02077:18:000000000-A88N7:1:1101:20129:1679 1:N:0:1|o:223|m/o:0.026906|MR:n=0;r1=5;r2=1|Q30:n/a|CO:0|mismatches:6
agaagctatcgctgaattttcccccctggaacaggaggacgttatgcagttaacaaccagttggatgcttcagggcattgaacagggcatCgaacgtggacaaaaatctctgctactcaaacaaattagacatcgTtttggagagttgaatgcagttaatTtgtcgaggattgacattctcaCagtgcctcaattggaacagttggGagaagtgctgttggactgctctgatttcgcagaattagaacaatggctagcggcccaatCtgaaacacctgagcgaaaaatttagtgaatttccagaggtggatgttgccatgaatgttcccaaagaatcaggtttcaaccatcggcttacaattccaaactgagttgata
- --min-overlap-size Minimum expected overlap. Default is 15.
- --max-num-mismatches Maximum number of mismatches at the overlapped region to retain the pair. The default behavior relies on `-P` parameter an does not pay attention to the number of mismatches at the overlapped region.
- -P Any merged sequence with P below the declared value is discarded and stored in a seperate file.
- --min-qual-score Minimum Q-score for a base to overwrite a mismatch at the overlapped region. If there is a mismatch at the overlapped region, the base with higher quality is being used in the final sequence. Alternatively, if the Q-score of the base with higher quality is lower than the Q-score declared with this parameter, that base is being marked as an ambiguous base, which may result in the elimination of the merged sequence depending on the --ignore-Ns paranmeter. The default value is 15.
- --retain-only-overlap When set, merger will only return the parts of reads that do overlap, and parts of reads that do not overlap will be trimmed.
e_coli_STATSにはレポートが出力される。
完全にオーバーラップしているリードだけマージする。
iu-merge-pairs e_coli.ini --marker-gene-stringent --retain-only-overlap --max-num-mismatches 0
クオリティフィルタリングは公式ページを参照してください。
引用
A Filtering Method to Generate High Quality Short Reads Using Illumina Paired-End Technology
A. Murat Eren , Joseph H. Vineis , Hilary G. Morrison, Mitchell L. Sogin
PLoS One. 2013 Jun 17;8(6):e66643
